李 賽， 潘 磊， 高瑞蘭， 趙燕娜， 余瀟苓， 尹利明△

(1浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院， 浙江 杭州 310053； 2浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院， 浙江 杭州 310006)

蛇六谷是天南星科(Araceae)魔芋屬(Amorphophallus)多年生草本植物的干燥塊莖，又名魔芋、蒟蒻。經(jīng)考證，浙江地區(qū)藥用“蛇六谷”為花魔芋的塊莖[1-2]。本文所用蛇六谷提取物(the extract fromAmorphophalluskonjactuber，TuAKe)是天南星科魔芋屬花魔芋的干燥塊莖，經(jīng)用95%乙醇提取、乙酸乙酯萃取后再經(jīng)石油醚萃取回收溶劑而成。研究表明，蛇六谷石油醚萃取物能明顯抑制腫瘤細胞增殖[3-4];當前蛇六谷多用于胰腺癌、乳腺癌和惡性淋巴瘤等惡性腫瘤中，對白血病的治療仍未有確切報道。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

人慢性髓系白血病細胞株K562由浙江省中醫(yī)院血液病研究所保存。IMDM培養(yǎng)基購自Gibco；小牛血清購自杭州四季青公司；TuAKe由浙江省中醫(yī)院中藥房用天南星科魔芋屬花魔芋的干燥塊莖以95% 乙醇提取、乙酸乙酯萃取后再經(jīng)石油醚萃取回收溶劑制成；PE標記的小鼠抗人CD11b、CD14和CD42b 抗體購自BD；抗細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、細胞周期蛋白E1(cyclin E1)和紅系分化核轉錄因子GATA-1抗體購自 Cell Signaling Technology(CST)；抗β-actin抗體購自聯(lián)科生物技術有限公司。

2 主要方法

2.1細胞培養(yǎng)和實驗分組 將K562 細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。TuAKe用IMDM培養(yǎng)基配成所需濃度, 脂溶物以DMSO助溶, DMSO 最終濃度小于0.1%。實驗分為對照(control)組、50 mg/L TuAKe組和100 mg/L TuAKe組。

2.2瑞氏-姬姆薩染色觀察細胞形態(tài)的改變 取對數(shù)生長期的K562 細胞，調(diào)整細胞濃度至1×108/L，分別加入不同濃度的TuAKe，分別接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×105細胞(3 mL),TuAKe終濃度分別為0、50 和100 mg/L。上述培養(yǎng)體系置37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，隔天換液，培養(yǎng)3 d 后收集細胞，細胞離心涂片機制作細胞涂片。瑞氏-姬姆薩復合染色法染色，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

2.3MTT比色法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的K562細胞，調(diào)整細胞濃度至1×108/L，將各組細胞分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔2×104/L細胞(200 μL)，復種6孔。上述培養(yǎng)體系置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入濃度為5 g/L 的MTT 20 μL，在相同條件下繼續(xù)孵育4 h。離心棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，微量振蕩器振蕩5 min，使結晶完全溶解，酶標儀檢測490 nm波長的吸光度(A)值，計算各實驗組細胞生長的抑制率。該實驗重復3次。細胞生長抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

2.4K562細胞半固體集落形成實驗 計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為5×106/L，進行K562白血病細胞集落培養(yǎng)，培養(yǎng)體系為IMDM培養(yǎng)液、30%新生牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U青/鏈霉素和0.3%瓊脂，接種于24孔板，每孔2.5×102個細胞(0.5 mL)，重復3 孔。置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。以大于40個細胞的聚合為1個K562白血病細胞集落，記錄K562的細胞集落數(shù)，并計算抑制率(%)=(對照組集落數(shù)-實驗組集落數(shù))/對照組集落數(shù)×100%。同樣的實驗重復3次。

2.5流式細胞術檢測細胞周期分布 收集各組細胞，PBS洗滌并調(diào)整細胞濃度為1×109/L，各組取100 μL細胞懸液，按試劑盒說明書將1 mL DNA staining solution和1 μL permeabilization solution分別加入各組細胞懸液中，4 ℃孵育30 min，流式細胞術檢測各組細胞周期，每個檢測標本記錄10 000個細胞。MFL T32軟件進行細胞周期分析。同樣的實驗重復3次。

2.6流式細胞術檢測分化相關抗原陽性表達率 收集各組細胞，PBS洗滌并調(diào)整細胞濃度為1×109/L，取100 μL細胞懸液分別加入抗分化相關抗原CD11b、CD14和CD42b 的單克隆抗體，4 ℃孵育30 min，PBS洗去未結合的抗體，流式細胞術檢測細胞陽性表達率，每個檢測標本記錄10 000個細胞。DIVA軟件進行陽性率的分析。同樣的實驗重復3次。

2.7Western blot法檢測K562細胞周期相關蛋白的表達 按照本研究所已報道的方法，采用細胞裂解液(含50 mmol/L TRIS、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100和蛋白酶抑制劑)提取總蛋白。制備SDS-PAGE凝膠，上樣量為每孔40 μg，80 V電泳6 h，電壓100 V轉膜1 h，將蛋白條帶轉至NC膜上，PBST洗膜3次，5% BSA封閉1 h，分別加抗CDK2、cyclin E1和GATA-1等抗體，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次后加入Ⅱ抗(購自聯(lián)科生物)孵育1 h，經(jīng)充分洗滌后用ECL發(fā)光劑采用灰度掃描系統(tǒng)測定并分析目的蛋白條帶。同樣的實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 TuAKe誘導細胞形態(tài)學的改變

鏡下顯示，TuAKe作用K562細胞3 d，相較于對照組，50和100 mg/L劑量組可見不同程度的細胞體積增大，細胞內(nèi)可見空泡，胞漿豐富，細胞核偏向一側，部分甚至出現(xiàn)裸核等形態(tài)學改變，見圖1。

2 TuAKe抑制K562細胞增殖

TuAKe處理K562細胞3 d，50和100 mg/L TuAKe 組的A值明顯低于對照組(P<0.01)。TuAKe處理K562細胞7 d，50和100 mg/L TuAKe組K562細胞的集落數(shù)明顯低于對照組(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.The morphological changes of K562 cells induced by TuAKe (×400)．

圖1TuAKe對K562細胞形態(tài)的影響

Figure 2.The viability of K562 cells detected by MTT assay and colony formation assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2MTT實驗和集落形成實驗證實TuAKe抑制K562細胞增殖

3 TuAKe對K562 細胞周期分布的影響

分別處理K562細胞3 d，流式細胞術分析細胞周期分布情況,結果顯示在TuAKe作用下，50和100 mg/L組G0/G1期的細胞比例明顯增高，G2/M期的細胞比例明顯增加，S 期細胞比例逐漸下降(P<0.05)，見圖3。

4 TuAKe提高K562 細胞分化相關抗原陽性表達率

TuAKe處理K562細胞7 d，流式細胞術檢測K562 細胞分化程度，結果顯示K562細胞分化相關抗原CD11b、CD14和CD42b的陽性表達率均明顯高于對照組(P<0.01)，見圖4。

5 TuAKe對K562細胞CDK2、cyclin E1和GATA-1蛋白表達水平的調(diào)節(jié)作用

Western blot 實驗結果顯示，隨著藥物濃度增加，TuAKe能夠下調(diào)K562細胞的CDK2和cyclin E1的表達，上調(diào)GATA-1的表達(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

討 論

Cyclin E1調(diào)控細胞從G1期向S期轉換，通過激活CDK2，調(diào)控細胞的有絲分裂過程[5]。Cyclin E-CDK2復合物是細胞從G1期進入S 期的關鍵激酶，能促進細胞由G1期向S 期轉化，從而促進細胞增殖[6-8]。Cyclin E1表達上調(diào)是誘導細胞周期調(diào)控異常導致腫瘤發(fā)生的主要原因之一。研究表明[9]，cyclin E1在多種腫瘤細胞中過度表達，在腫瘤細胞中其表達見于整個細胞周期。我們的實驗結果顯示，TuAKe處理K562細胞72 h，下調(diào)細胞周期蛋白cyclin E1和周期蛋白依賴性激酶CDK2的表達，抑制細胞進入S期，同時細胞阻滯在G2/M 期；同時，我們觀察到，濃度為50和100 mg/L TuAKe能夠顯著減少K562細胞集落形成的，抑制K562細胞增殖，抑制率達到41.9%～69.1%。MTT結果顯示50～100 mg/L TuAKe可明顯抑制K562細胞活力，抑制率達到25.1%～53.8%，說明TuAKe通過下調(diào)cyclin E1和CDK2的表達，部分阻滯K562細胞從G2/M進入S期，抑制K562細胞增殖。

誘導分化是指利用分化誘導劑，不殺傷腫瘤細胞，誘導其細胞形態(tài)、功能及生物學行為等綜合指標向正常細胞靠攏，使惡性腫瘤細胞具有分化為正?；蚪咏＜毎哪芰?。研究表明，K562細胞在體外被藥物誘導后可向巨核系、粒系、單核系或紅系分化[10-12]。我們觀察了TuAKe對K562細胞分化的誘導作用，結果顯示，在50～100 mg/L濃度范圍內(nèi)K562細胞可誘導K562細胞分化。K562細胞的形態(tài)也發(fā)生變化，相較于對照組，各劑量組出現(xiàn)不同程度的細胞體積增大，細胞內(nèi)空泡，細胞核側偏等形態(tài)學改變。我們檢測了粒系分化抗原CD11b、粒-單系細胞分化抗原CD14、巨核系分化抗原CD42b和紅系分化蛋白GATA-1，結果顯示分化相關抗原陽性表達率皆有不同程度的增高，紅系分化蛋白GATA-1表達增高，其促進分化相關抗原陽性表達的作用呈現(xiàn)出濃度依賴性，而50～100 mg/L劑量組范圍，各系分化的差異具有統(tǒng)計學意義，說明TuAKe具有較強的誘導K562細胞多向分化的能力。

Figure 3.TuAKe changed the cell cycle distribution of the K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3TuAKe對K562細胞周期分布的影響

Figure 4.TuAKe changed the differentiation of the K562 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4TuAKe對K562細胞分化的影響

Figure 5.TuAKe regulated the protein expression of CDK2 and cyclin E1 in the K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5TuAKe對K562細胞周期蛋白表達水平的調(diào)節(jié)作用

目前人們試圖找到特異性更高、作用點更明確、不良反應更小的藥物來抑制CDK2及其相關蛋白的活性，從而阻止腫瘤細胞的增殖以達到控制甚至根治腫瘤的目的已成為人們治療腫瘤的新方向[13-15]。TuAKe是目前常用的抗腫瘤及抗腫瘤轉移的中藥，但目前對TuAKe殺死腫瘤細胞的有效化學成分、作用機制以及有效作用靶點尚不明確，對其毒性成分及其機制的研究也很少，所以作為抗癌中藥，TuAKe有著很高的研究價值，本研究首次將TuAKe應用于慢性髓系白血病細胞株K562細胞增殖抑制研究中，并初步證實TuAKe抑制K562細胞增殖并誘導分化,其抑制K562細胞增殖的作用是通過下調(diào)cyclin E1和CDK2的表達并將細胞阻滯在G2/M期而實現(xiàn)的。