竇 艷， 邱 鵬， 馬立志， 陳江偉

(邢臺市人民醫(yī)院， 河北醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科， 河北 邢臺 054000)

結(jié)腸癌是最為常見的消化道惡性腫瘤，其好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，發(fā)病率占到胃腸道腫瘤的第3位，但其早期癥狀多不明顯，大約20%的病人在獲得確診時腫瘤細(xì)胞已發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響結(jié)腸癌患者的治療和預(yù)后[1]。同時，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌在我國大部分城市的發(fā)病率和死亡率也呈漸上升趨勢。因此，對結(jié)腸癌進行早期診治并防止其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移是當(dāng)前醫(yī)學(xué)的研究重點之一[2]。

NOB1(Nin one binding 1)基因也稱為鋅帶蛋白基因，是一個重要的編碼結(jié)合蛋白4基因；NOB1的異常表達能夠?qū)е碌鞍酌阁w和核糖體的合成異常，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡等功能活動[3]。NOB1在人類不同組織器官中均有表達，但表達量各有差異。近年研究發(fā)現(xiàn)，NOB1在腫瘤組織中表達量不同于正常組織，其在肝癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中呈高表達，而人為敲除NOB1基因能夠阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖生長，提示NOB1參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展中[4]；吳東平等[5]研究發(fā)現(xiàn)，NOB1基因在胃癌組織中表達高于邊緣胃黏膜，并且NOB1高表達促進胃癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移；同時Misale等[6]發(fā)現(xiàn)，NOB1在人類前列腺惡性腫瘤中表達水平升高，其在前列腺癌成瘤過程中起正相關(guān)作用；武月等[7]的研究已揭示NOB1在結(jié)直腸癌中表達明顯高于正常大腸黏膜及息肉中的表達水平，并且NOB1的表達水平與結(jié)直腸癌細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)。上述研究均提示NOB1可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，但關(guān)于NOB1具體如何發(fā)揮作用及其能否成為抑制并治療高侵襲性結(jié)腸癌疾病的新靶向分子，尚有待進一步研究。因此，本研究利用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)敲減人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中NOB1基因的表達，并揭示敲減NOB1表達對SW480細(xì)胞活力、化療藥物敏感性、凋亡、細(xì)胞周期及侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，以探索NOB1基因能否作為結(jié)腸癌診治的新靶點。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25% EDTA胰酶購自Gibco；Lipofectamine 3000脂質(zhì)體購自Invitrogen；NOB1 siRNA及陰性對照無義siRNA(control siRNA)由上海生工公司合成；RNAiso Plus提取試劑、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光Real-Time PCR試劑盒購自TaKaRa；Transwell小室購自Corning；Matrigel購自Sigma；蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京碧云天公司；多克隆兔抗人NOB1和β-actin抗體購自Abcam；HRP標(biāo)記多克隆山羊抗兔IgG II抗和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染 將人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至70%以上后進行消化傳代以進行后續(xù)實驗。取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80%以上后進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)GenBank上NOB1基因序列和siRNA設(shè)計原則，由上海生工公司設(shè)計合成NOB1 siRNA和control siRNA,序列見表1。采用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分組為未做任何處理的空白對照組(control組)、control siRNA組和NOB1 siRNA組。在轉(zhuǎn)染24～48 h后收集各組細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

2.2Real-time PCR和Western blot檢測NOB1 siRNA的沉默效率 在SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化收集各組細(xì)胞，利用TRIzol方法提取各組細(xì)胞中的總RNA，并按照TaKaRa的逆轉(zhuǎn)錄盒逆轉(zhuǎn)錄得到各組cDNA。根據(jù)人NOB1 cDNA和內(nèi)參照β-actin序列設(shè)計real-time PCR引物(由上海生工公司合成，見表1)。利用Bio-Rad公司的real-time PCR儀檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后NOB1基因相對表達量。同時在各組SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞用RAPI強細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞中總蛋白。利用BCA試劑盒測定各組蛋白濃度后每組取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE。在電泳結(jié)束后半干法轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉30 min后，4 ℃孵育多克隆兔抗人NOB1和β-actin抗體(1∶1 000)過夜，TBST洗滌3次，室溫孵育山羊抗兔IgG II 抗(1∶5 000)2 h，TBST洗滌3次后，利用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光顯影并拍照。利用QualityOne軟件分析各組細(xì)胞中NOB1蛋白相對表達量。

2.3MTT法檢測轉(zhuǎn)染后各組SW480細(xì)胞活力和不同藥物的敏感性 將各轉(zhuǎn)染組的SW480細(xì)胞按照每孔1×107/L種植于96孔培養(yǎng)板中，分別在0、12、24、36、48、60和72 h時，每孔中加入20 μL的MTT(5 g/L)溶液，在37 ℃時孵育4 h后棄去上清，每孔中加入150 μL的DMSO混勻10 min后，在酶標(biāo)儀上測定550 nm處各孔的吸光度(A)值以反映各組細(xì)胞的活力。每組細(xì)胞設(shè)置6個復(fù)孔，并進行3次重復(fù)實驗。按照上述MTT方法對轉(zhuǎn)染后各組SW480細(xì)胞對相關(guān)藥物的敏感性，取轉(zhuǎn)染24 h對數(shù)期生長的各組SW480細(xì)胞種植于96孔板中，分別加入0.625、1.25、2.5、5、10和20 μmol/L的化療藥物(順鉑、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、卡培他濱)培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液，按照上述方法測定各孔的A值。利用Prism 5.02軟件計算每種化療藥物的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后各組SW480細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡 各組SW480細(xì)胞在分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，消化離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的乙醇固定3 h后，每組細(xì)胞中加入10 μL的PI避光孵育30 min,結(jié)束后用PBS洗1次后，利用BD Caliber 4色流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期變化。同時，根據(jù)上述實驗結(jié)果將各組轉(zhuǎn)染24 h的SW480細(xì)胞，不更換培養(yǎng)基繼續(xù)連續(xù)培養(yǎng)48 h，消化離心收集細(xì)胞。分別用5 μL的FITC標(biāo)記的Annexin V和10 μL的PI室溫孵育20 min,后用PBS洗滌2次，上樣流式細(xì)胞儀檢測各組轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞在DDP作用下的細(xì)胞凋亡率變化。

2.5Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后各組SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力 將各組轉(zhuǎn)染24 h后的SW480細(xì)胞調(diào)整濃度為1×108/L，用含2%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋。在各組Transwell板上室膜上均勻涂抹1 g/L的Matrigel 50 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中30 min，使形成基底膜結(jié)構(gòu)。上述稀釋的SW480細(xì)胞各取100 μL加入到Transwell上室中，而下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染對照組，每組3個重復(fù)。將Transwell板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束用4%多聚甲醛固定小室濾膜，并用棉簽擦去上表面細(xì)胞。用結(jié)晶紫染色濾膜10 min后PBS洗滌2遍，在顯微鏡下觀察各組穿過濾膜侵襲的細(xì)胞，拍照并計算各組SW480細(xì)胞侵襲率。侵襲率(%)=各組平均侵襲細(xì)胞數(shù)/未處理對照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。而細(xì)胞遷移實驗即為上述實驗步驟中在Transwell小室中不加入Matrigel，培養(yǎng)時間為24 h，其它步驟同侵襲實驗。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及Bonferroni校正后兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后NOB1的mRNA和蛋白表達情況

通過real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與control組和control siRNA組相比，NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，細(xì)胞中NOB1的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)，見圖1。這說明通過NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染能夠沉默SW480細(xì)胞中NOB1基因表達。

Figure 1.The expression of NOB1 at mRNA (A) and protein (B) levels determined by real-time PCR and Western blot after transfected withNOB1 siRNA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group and control siRNA group.

圖1Real-timePCR和Westernblot檢測NOB1siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中NOB1的mRNA和蛋白表達變化

2 NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測發(fā)現(xiàn)NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后細(xì)胞活力顯著下降。在轉(zhuǎn)染12 h時，NOB1 siRNA組SW480細(xì)胞的A值與control組和control siRNA組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；而在轉(zhuǎn)染24～72 h時，NOB1 siRNA組SW480細(xì)胞的A值顯著低于control組和control siRNA組(P<0.05)，見圖2。這說明敲減NOB1基因表達對SW480細(xì)胞活力具有明顯抑制作用。

3 NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞對不同化療藥物敏感性的影響

通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞能夠顯著提高細(xì)胞對順鉑、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑和卡培他濱等化療藥物的敏感性與control組和control siRNA組相比，順鉑、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑和卡培他濱對NOB1 siRNA組SW480細(xì)胞的IC50均顯著下降(P<0.05)，見表2。

Figure 2.The viability of SW480 cells after transfection with NOB1 siRNA were detected by MTT assay. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group and control siRNA group.

圖2MTT檢測NOB1siRNA轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞活力的變化

表2NOB1siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞對不同化療藥物敏感性IC50的影響

Table 2.The effect ofNOB1 siRNA transfection on the IC50of different chemotherapeutic agents for SW480 cells (μmol/L. Mean±SEM.n=6)

GroupCisplatin5-fluorouracilOxaliplatinCapecitabineControl6.35±0.257.14±0.4713.21±0.429.45±0.38Control siRNA6.11±0.317.05±0.3512.96±0.459.13±0.29NOB1 siRNA3.02±0.22?5.18±0.33?4.36±0.29?6.96±0.17?

*P<0.05vscontrol group and control siRNA group.

4 NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞能夠顯著促進細(xì)胞凋亡。與control組和control siRNA組相比，NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.Flow cytometry was used to detect the apoptosis of SW480 cells after transfection withNOB1 siRNA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group and control siRNA group.

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測NOB1siRNA轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞凋亡的變化

5 NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞能夠阻滯其細(xì)胞周期于G0/G1期。與control組和control siRNA組相比，NOB1 siRNA組G0/G1期比值顯著上升(P<0.05)；與control組和control siRNA組相比，NOB1 siRNA組S期比值顯著下降(P<0.05)；與control組和control siRNA組的G2期比值相比，NOB1 siRNA組G2期比值顯著下降(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.Flow cytometry was used to detect the changes of cell cycle distribution in the SW480 cells after transfection withNOB1 siRNA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group and control siRNA group.

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測NOB1siRNA轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞周期的變化

6 NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染后對SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn)NOB1 siRNA轉(zhuǎn)染能夠顯著抑制SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力。與control組和control siRNA組細(xì)胞相比，NOB1 siRNA組SW480細(xì)胞的侵襲率顯著下降(P<0.05)；與control組和control siRNA組細(xì)胞相比，NOB1 siRNA組SW480細(xì)胞的遷移率顯著下降(P<0.05)，見圖5。

討 論

結(jié)腸癌作為人類常見的惡性消化道腫瘤之一，其具有易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移且死亡率高的特點[8]。近年結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率逐年上升，晚期患者容易發(fā)生耐藥性導(dǎo)致生存率降低，但其作用機制尚未完全研究清楚，因此，針對結(jié)腸癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥性的研究一直是臨床研究中的熱點[9]。NOB1基因是一個新發(fā)現(xiàn)的核蛋白基因，已有研究確定NOB1對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用，其在多種惡性腫瘤的癌變信號通路傳導(dǎo)中發(fā)揮功能，并與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。武月等[7]利用免疫組化技術(shù)檢測了多例結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸黏膜組織中NOB1表達特征，發(fā)現(xiàn)NOB1蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達率顯著升高，并且與結(jié)直腸癌細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)。為進一步研究NOB1基因如何在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，我們成功利用siRNA技術(shù)敲減結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中NOB1基因表達，并利用MTT方法檢測發(fā)現(xiàn)敲減NOB1表達后，SW480細(xì)胞活力顯著下降。本研究中結(jié)果與Lin等[11]在卵巢癌、乳腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中所發(fā)現(xiàn)NOB1低表達能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖的結(jié)論相一致。

據(jù)臨床統(tǒng)計確診為結(jié)腸癌的病人中，有20%～30%的患者已經(jīng)是IV期，僅靠手術(shù)無法完全根治，而需要化學(xué)藥物進行化療[12]。同時研究表明消化道腫瘤中，結(jié)腸癌較胃癌具有強的多藥耐藥性，而結(jié)腸癌細(xì)胞對一般化療藥物的敏感性降低會嚴(yán)重影響其治愈率和復(fù)發(fā)性[13]。研究發(fā)現(xiàn)NOB1基因在C端編碼一個保守的鋅帶結(jié)構(gòu)域，而鋅帶結(jié)構(gòu)域在ZNRD1等腫瘤耐藥性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄分子中均存在，因此推測NOB1基因在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性中發(fā)揮作用[14]。同時已有研究表明抑制NOB1表達可以顯著改善食管癌的藥物敏感性，其對多藥耐藥性的調(diào)控作用可成為新的基因療法[15]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，siRNA技術(shù)抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中NOB1基因表達后，其對5-氟尿嘧啶、順鉑、奧沙利鉑和卡培他濱等常規(guī)化療藥物的半數(shù)致死濃度均顯著降低，證實抑制NOB1表達能夠提高結(jié)腸癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，其可能成為未來結(jié)腸癌潛在治療手段之一。

Figure 5.The invasion and migration abilities of SW480 cells after transfection withNOB1 siRNA detected by Transwell assays. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group and control siRNA group.

圖5Transwell檢測NOB1siRNA轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化

上述研究已證實NOB1基因在結(jié)腸癌的病理進展中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于其能否成為結(jié)腸癌新的基因診斷和治療靶點尚未見。有研究發(fā)現(xiàn)NOB1在真核生物核糖體26S蛋白酶的合成和20S蛋白酶成熟中扮演重要的角色，而26S蛋白酶會影響到腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[16]。NOB1高表達可促進26S蛋白酶的合成和20S蛋白酶成熟，進而促進腫瘤細(xì)胞增殖并抑制凋亡[17].。為了具體揭示NOB1如何影響結(jié)腸癌細(xì)胞相關(guān)功能，本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中抑制NOB1表達后，腫瘤細(xì)胞凋亡率會顯著上升，說明NOB1低表達可促進結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞增殖和凋亡均受到細(xì)胞周期的影響，當(dāng)細(xì)胞周期受到阻滯后會影響其增殖活力和凋亡能力，而細(xì)胞周期中G0+G1期細(xì)胞對凋亡信號更為敏感[18]。同時本研究也利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了敲減NOB1表達后結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的周期變化，結(jié)果表明其能夠阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，說明NOB1能夠通過抑制細(xì)胞周期來調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡。腫瘤患者是否容易復(fù)發(fā)及預(yù)后與癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。有研究顯示NOB1表達與食管鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移侵襲能力相關(guān)，但其如何影響結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移尚未知[19]。本研究中同時利用Transwell方法檢測發(fā)現(xiàn)敲減NOB1表達后SW480細(xì)胞相對侵襲率和轉(zhuǎn)移率均顯著降低，證實NOB1低表達可抑制結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其對于晚期結(jié)腸癌病人治療和預(yù)后具有重要意義。

綜上所述，本研究證實NOB1參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，用siRNA沉默NOB1表達可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移并促進結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和藥物敏感性。NOB1可能是一個結(jié)腸癌腫瘤標(biāo)志物或促癌蛋白，在結(jié)腸癌分子靶向治療中具有較好的臨床價值。