符 亮， 潘 銳， 陳 釗

(三亞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 海南 三亞 572000)

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生存質(zhì)量。臨床上，胃癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者治療失敗和不良預(yù)后的主要因素之一[1]。近年來(lái)的研究證實(shí)，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)參與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的典型特點(diǎn)是上皮細(xì)胞表型缺失，其上皮標(biāo)志蛋白上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)降低，失去極性，并且表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的特性，間質(zhì)標(biāo)志蛋白神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的表達(dá)增加[2]。

高遷移率族蛋白(high-mobility group protein，HMG)是在真核生物中廣泛存在的一類染色質(zhì)相關(guān)蛋白，主要包括HMGA、HMGB和HMGN家族成員。HMGA2是HMGA家族成員之一，在胚胎期及分化程度低的組織中大量表達(dá)，而在分化程度高的組織中幾乎不表達(dá)[3]。在胃癌組織中，HMGA2呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并且與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[4-5]，但具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。本研究探討胃癌細(xì)胞EMT過(guò)程中，HMGA2的作用及可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌細(xì)胞株MKN45(低分化)、MKN28(高分化)和SGC7901(中分化)以及人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1購(gòu)自中國(guó)上海科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；脂質(zhì)體Lipofectamine?3000(Invitrogen)；HMGA2 siRNA(si-HMGA2)和siRNA陽(yáng)性對(duì)照(siRNA negative control,si-NC)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；TRIzol(Thermo)；RNA提取試劑盒(Invitrogen)；紫外分光光度計(jì)(Thermo)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；RT-qPCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；定量PCR擴(kuò)增儀(ABI 7500，Applied Biosystems)；RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)；兔抗人HMGA2多克隆抗體(ab97276)、兔抗人E-cadherin單克隆抗體(ab11512)、兔抗人vimentin多克隆抗體(ab92547)和兔抗人N-cadherin單克隆抗體(ab18203)均購(gòu)自Abcam；兔抗人GAPDH單克隆抗體(sc-367714，Santa)； HRP標(biāo)記的羊抗鼠 II 抗(上海英基生物科技有限公司)；CCK-8試劑(上海翊圣生物科技有限公司)；ECL發(fā)光液(Millipore)。凝膠成像儀(GelDoc-It，UVP)；顯微鏡(BX61，Olympus)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 4種細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中(青霉素1×105U/L，鏈霉素100 mg/L)，37 ℃、5% CO2條件下中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度值80%～90%時(shí)，進(jìn)行消化傳代。

2.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增HMGA2基因編碼區(qū)(NM_001300918.1)，BamH I和EcoR I酶切后，插入pcDNA3.0真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定，構(gòu)建pcDNA3.0-HMGA2表達(dá)載體。取4×105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN28細(xì)胞，接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，24 h后，采用脂質(zhì)體Lipofectamine?3000將pcDNA3.0-HMGA2及空載體對(duì)照pcDNA3.0-empty分別轉(zhuǎn)染至MKN28細(xì)胞中，操作步驟參照試劑說(shuō)明書。

取4×105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN45細(xì)胞，接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，24 h后，采用脂質(zhì)體Lipofectamine?3000將si-HMGA2(見(jiàn)表1)及si-NC(陰性對(duì)照組)分別轉(zhuǎn)染至MKN45細(xì)胞中，操作步驟參照試劑說(shuō)明書。

2.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 收集1×105細(xì)胞，各細(xì)胞樣品中加入1 mL TRIzol，抽提細(xì)胞總RNA，按照RNA提取試劑盒的說(shuō)明書操作。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度及純度(A260/A280)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。HMGA2、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1及內(nèi)參照GAPDH的RT-qPCR引物序列見(jiàn)表1。定量PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)各目的基因的mRNA表達(dá)水平。qPCR擴(kuò)增體系為10 μL，反應(yīng)條件為:50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示各目的基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 si-HMGA2序列及RT-qPCR引物序列

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 收集(2～5)×105個(gè)細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，抽提細(xì)胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，加入Ⅰ抗[兔抗人HMGA2多克隆抗體(1 ∶1 000稀釋)、兔抗人E-cadherin單克隆抗體(1 ∶1 000稀釋)、兔抗人vimentin多克隆抗體(1 ∶1 000稀釋)、兔抗人N-cadherin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)和兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶2 000稀釋)]，4 ℃孵育過(guò)夜。TBS-T洗膜后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠II 抗(1 ∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀對(duì)蛋白條帶進(jìn)行觀察，獲取圖像，并對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析(Image Lab軟件)，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。

2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(would healing assay) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(5～7)×105個(gè)，接種于6孔板中，24 h后，細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上；使用移液器槍頭，垂直于6孔板底部，均勻劃線，每孔3條平行線；PBS洗滌3次，去除漂浮的細(xì)胞，加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，分別于0 h和24 h時(shí)在顯微鏡下拍照，并計(jì)算細(xì)胞間距離。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell assay) 24孔板中放置Transwell小室，在小室上層加入4.0 g/L Matrigel 50 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使Matrigel凝固；在24孔板下室中加入500 μL的含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，Transwell小室中加入100 μL的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)約1×105個(gè))；48 h后，去除24孔板下室中的培養(yǎng)液，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)室膜上的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，室溫5 min，顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，并記錄每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.7細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔接種(0.8～1)×104個(gè)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去上清，加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度(A)值。進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用經(jīng)Bonferroni法校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胃癌細(xì)胞和胃黏膜上皮細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)水平

RT-qPCR和Western blot 結(jié)果顯示，HMGA2在低分化的MKN45胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平最高，而在永生化的GES-1胃黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)水平最低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2 轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，在MKN28細(xì)胞中，與空白對(duì)照(MKN28-control)組和空載體(MKN28-empty)組相比，HMGA2過(guò)表達(dá)(MKN28-HMGA2)組細(xì)胞中HMGA2的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，而空白對(duì)照組和空載體組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2A、B。在MKN45細(xì)胞中，與空白對(duì)照(MKN45-control)組和陰性對(duì)照(MKN45-NC)組相比，HMGA2干擾(MKN45-si-HMGA2)組HMGA2的mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2C、D。

3 HMGA2表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與MKN28-control組和MKN28-empty組相比，MKN28-HMGA2組的細(xì)胞活力在第4天和第5天均顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3A；與此同時(shí)，與MKN45-control組和MKN45-NC組相比，MKN45-si-HMGA2組的細(xì)胞活力在第3天、第4天和第5天均顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。

Figure 1.The expression of HMGA2 at mRNA (A) and protein (B) levels in the gastric cancer cell lines and gastric epithelial cell line. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28, SGC7901 and GES-1 cells;#P<0.05vsMKN45, MKN28 and SGC7901 cells.

圖1胃癌細(xì)胞和胃黏膜上皮細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)水平

Figure 2.The transfection efficiency of liposomes in the MKN28 (A and B) and MKN45 cells (C and D). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28-control group and MKN28-empty group;#P<0.05vsMKN45-control group and MKU45-NC group.

圖2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MKN28及MKN45細(xì)胞的效率測(cè)定

Figure 3.The effects of HMGA2 up- or down-regulation on the viability of MKN28 cells (A) and MKN45 cells (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28-control group and MKN28-empty group;#P<0.05vsMKN45-control group and MKN45-NC group.

圖3上調(diào)或下調(diào)HMGA2對(duì)MKN28和MKN45細(xì)胞活力的影響

4 HMGA2過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕和侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MKN28-HMGA2組的遷移和侵襲能力均顯著高于空白對(duì)照組和空載體組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

5 HMGA2對(duì)胃癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，MKN28-HMGA2組細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)量相對(duì)于MKN28-control組和MKN28-empty組均明顯降低(P<0.05)，而N-cadherin及vimentin的蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05);E-cadherin、N-cadherin及vimentin的蛋白表達(dá)水平在MKN28-control組和MKN28-empty組之間比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖5A。

在MKN45-si-HMGA2組的細(xì)胞中，E-cadherin蛋白的表達(dá)量相對(duì)于MKN45-control組和MKN45-NC組均明顯增加(P<0.05)，而N-cadherin及vimentin蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；E-cadherin、N-cadherin及vimentin蛋白表達(dá)水平在MKN45-control組和MKN28-NC組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖5B。

6 HMGA2過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞Wnt/β-catenin通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)水平在MKN28-control組和MKN28-empty組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而MKN28-HMGA2組較這2組均明顯增加(P<0.05)；MKN28-HMGA2組c-Myc的mRNA相對(duì)表達(dá)水平較MKN28-control組和MKN28-empty組有明顯增加(P<0.05)，后2組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；MKN28-HMGA2組cyclin D1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平較MKN28-control組和MKN28-empty組明顯增加(P<0.05)，后2組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖6。

討 論

胃癌是死亡率僅次于肝癌和肺癌的惡性腫瘤之一，我國(guó)每年新發(fā)胃癌病例數(shù)約占全球每年新發(fā)病例數(shù)的41%，且每年因胃癌死亡人數(shù)約占全球因胃癌死亡人數(shù)的35%[6]。目前臨床上胃癌的治療采用的是以手術(shù)為主，化療、放療、分子靶向治療以及免疫治療相結(jié)合的綜合治療方案。

EMT在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如胚胎形成、傷口愈合以及腫瘤轉(zhuǎn)移等[7]；此外，EMT在膀胱癌[8]和非小細(xì)胞肺癌[9]等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著極其重要的作用。上皮細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，細(xì)胞失去極性，并出現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞的表型，表現(xiàn)出更強(qiáng)的移動(dòng)性，然而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT的具體分子機(jī)制仍未完全明確。HMGA2最早是在間充質(zhì)來(lái)源的腫瘤中發(fā)現(xiàn)的[10]，作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，因此，HMGA2與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移過(guò)程中的EMT有關(guān)。事實(shí)上，多項(xiàng)研究也證實(shí)了此觀點(diǎn)，如HMGA2參與了前列腺癌[11]、乳腺癌[12]和直腸癌[13]等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究比較了不同分化程度的胃癌細(xì)胞和胃黏膜上皮細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在低分化的胃癌MKN45細(xì)胞中，HMGA2的表達(dá)水平最高，而在永生化胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞中，HMGA2表達(dá)水平最低。在MKN28細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)HMGA2后，細(xì)胞的活力顯著下降，而在MKN45細(xì)胞內(nèi)干擾HMGA2的表達(dá)后，明顯提高了細(xì)胞的活力。以上結(jié)果說(shuō)明,HMGA2在胃癌細(xì)胞中可能參與了細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控，并可能存在負(fù)相關(guān)的聯(lián)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HMGA2過(guò)量表達(dá)之后，MKN28細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HMGA2的高表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲。Zhang等[14]在舌癌中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)HMGA2能夠通過(guò)EMT途徑促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲。

Figure 4.The effects of HMGA2 over-expression on the migration (A, ×40) and invasion (B，×200) of MKN28 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28-control group and MKN28-empty group.

圖4HMGA2過(guò)表達(dá)對(duì)MKN28細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

關(guān)于HMGA2是否參與胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HMGA2所誘導(dǎo)的標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平變換與EMT過(guò)程相一致，如上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)降低，間充質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin和vimentin表達(dá)增加；而在HMGA2表達(dá)被抑制后，E-cadherin表達(dá)增加，N-cadherin和vimentin表達(dá)降低。以上結(jié)果驗(yàn)證了本研究的推測(cè)，HMGA2參與并且促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在MKN28細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HMGA2后，細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，即β-catenin及其下游分子c-Myc和cyclin D1的mRNA表達(dá)水平顯著增加。而多項(xiàng)研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，能夠促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT，所以HMGA2可能是通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究通過(guò)增加或抑制胃癌細(xì)胞中HMGA2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中β-catenin、c-myc和cyclin D1發(fā)生相應(yīng)變化，初步證實(shí)HMGA2參與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要分子β-catenin以及下游靶分子c-Myc和cyclin D1表達(dá)，為HMGA2作為胃癌靶向治療基因提供了依據(jù)。

Figure 5. The effects of HMGA2 up- or down-regulation on the expression of EMT-related proteins in MKN28 cells (A) and MKN45 cells (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28-control group and MKN28-empty group;#P<0.05vsMKN45-control group and MKN45-NC group.

圖5上調(diào)或下調(diào)HMGA2對(duì)EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. The effects of HMGA2 over-expression on the mRNA expression of Wnt/β-catenin signal pathway-related molecules in the MKN28 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28-control group and MKN28-empty group.

圖6HMGA2過(guò)表達(dá)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，HMGA2在胃癌細(xì)胞中的高表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞惡性表型的發(fā)生，即增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并且HMGA2有可能是通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，參與了胃癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。本研究的局限性在于沒(méi)有對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的其他相關(guān)基因及下游基因進(jìn)行檢測(cè)，而且HMGA2是通過(guò)何種機(jī)制誘導(dǎo)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，將在今后的研究中進(jìn)一步探究。