胡輝燦，劉 洋，姚 清，趙 墩，余興龍

(湖南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128)

豬丹毒是由紅斑丹毒絲菌(俗稱丹毒桿菌)引起的一種急性、熱性、烈性傳染病，廣泛分布于世界各地，是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展及豬丹毒疫苗的廣泛使用，豬丹毒得到了有效控制。但是近幾年有關(guān)豬丹毒的病例報道逐漸增多，表明豬丹毒的危害又日益嚴重[1-3]。

目前，免疫接種豬丹毒的傳統(tǒng)疫苗(滅活疫苗和弱毒疫苗)仍是預(yù)防豬丹毒最有效的方法，但這些疫苗均存在一定的缺陷，例如，滅活疫苗在滅活過程中可能導致抗原表位缺失或抗原性減弱，從而導致免疫效果不佳；弱毒疫苗因減毒不徹底會存在毒力返強的風險。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，開發(fā)高效安全的豬丹毒疫苗成為目前最迫切的需求。20世紀90年代，人們開始從基因水平上研制豬丹毒重組亞單位疫苗。SpaA(Surface protective antigen A)蛋白是豬丹毒重組亞單位疫苗的研究熱點，它是豬丹毒桿菌所有血清型共有的抗原，具有良好的免疫原性[4]。相較于傳統(tǒng)的疫苗而言，重組亞單位疫苗的抗原分子質(zhì)量較小，產(chǎn)生的抗體水平有限，因此，尋找一種能夠有效增強機體免疫力的分子物質(zhì)是目前基因工程疫苗的一個研究方向。

轉(zhuǎn)移因子(Transfer factor，TF)是存在于人和動物免疫淋巴細胞內(nèi)的小分子物質(zhì)，其主要成分是小分子多肽和低聚核苷酸。TF帶有致敏淋巴細胞的特異性免疫信息，在受者體內(nèi)能夠誘導T細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樘禺愋灾旅袅馨图毎?，因此，它能夠特異地將供者的細胞免疫功能被動地轉(zhuǎn)移到受者體內(nèi)，使受者獲得特異性細胞免疫功能[5]。自20世紀50年代發(fā)現(xiàn)TF以來，國內(nèi)外學者對其做過很多研究，發(fā)現(xiàn)其具有分子質(zhì)量小、無毒、無抗原性、不引起過敏反應(yīng)等一系列優(yōu)點，將其廣泛應(yīng)用于人畜疾病的防治，取得了一定的成績。在人醫(yī)臨床上，TF主要用于免疫缺陷、惡性腫瘤、抗病毒感染等領(lǐng)域的治療。20世紀80年代后，我國將TF應(yīng)用于獸醫(yī)免疫和臨床治療，大量研究表明，TF與動物疫苗同時使用能夠不同程度地增強機體產(chǎn)生特異性抗體的能力，且在治療畜禽疾病方面也存在一定效果[6-9]。

本研究制備了豬丹毒SpaA特異性TF及普通TF，比較了兩者之間的免疫活性，探討其特異性對豬丹毒基因工程亞單位疫苗的免疫增強作用，為TF在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗小鼠及分組 供試ICR雌性小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物中心(購買編號：43004700037007)。

1.1.2 主要儀器及試劑 大腸桿菌BL21(DE3)-SpaA由湖南農(nóng)業(yè)大學分子與免疫實驗室構(gòu)建并保存；IDA-4FF蛋白純化介質(zhì)購自武漢匯研生物科技有限公司；ISA201油佐劑購自法國賽比克公司；Amicon-Ultra-15超濾管(MWCO10KD)購自Merck Millipore公司；BCA蛋白定量測定試劑盒、MULTISKAN MK3酶標儀和低溫離心機均購自Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 SpaA疫苗的制備

1.2.1.1 SpaA蛋白的誘導表達 取10 μL大腸桿菌BL21(DE3)-SpaA甘油菌接種至10 mL具有卡那抗性且終質(zhì)量濃度為30 μg/mL的滅菌LB培養(yǎng)基中，置于搖床中37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h后，將復蘇菌種接種至200 mL滅菌LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min增菌至OD600為0.8左右，加入終質(zhì)量濃度為240 μg/mL的IPTG，37 ℃、180 r/min誘導6 h。誘導完畢，離心收集重組蛋白表達菌體，用10 mL超純水充分重懸菌體，超聲波破碎，取全菌和上清進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.1.2 SpaA蛋白的純化及疫苗制備 將離心后的上清液以Ni2+親和層析法進行蛋白質(zhì)純化，具體操作參考匯瓊親Ni-4FF(IDA)蛋白純化操作手冊，取純化后SpaA蛋白的流穿液、洗滌液、洗脫液進行SDS-PAGE電泳鑒定。

取5 mL蛋白質(zhì)純化液加入至等體積的ISA201佐劑中，充分攪拌混勻后配制成SpaA抗原，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠特異性TF的制備 將實驗室配制的豬丹毒SpaA抗原免疫10只ICR雌性小鼠(體質(zhì)量20～22 g)，每免疫1次間隔1 d，共免疫3次，每次免疫的疫苗劑量為100 μL，抗原含量為10 μg。第3次免疫21 d后，將小鼠剖殺，取脾臟并去除脂肪和被膜，用蒸餾水沖洗干凈后，稱質(zhì)量。用剪刀將脾臟剪碎，等量加入生理鹽水后，用高速勻漿機勻漿3次，每次1 min，反復凍融3次后，離心取上清，將上清液轉(zhuǎn)移至截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾管中，5 000×g離心30 min，收集超濾液，然后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠普通TF的制備 另取10只未免疫小鼠脾臟，按照1.2.2中方法，制得普通TF，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 BCA法測定小鼠TF 利用BCA蛋白定量測定試劑盒對小鼠TF進行測定，具體操作步驟參考Thermo公司BCA蛋白定量測定試劑盒操作說明書。

1.2.5 小鼠TF的無菌檢測 分別取10 μL小鼠特異性TF與普通TF接種到巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基倒扣于溫箱內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，進行無菌檢驗。

1.2.6 小鼠TF的安全性檢測 取100 μL小鼠特異性TF和普通TF分別腹腔接種2只小鼠，同時設(shè)置對照組接種等劑量的生理鹽水，于接種后48 h內(nèi)觀察并記錄小鼠的各項生理活動，48 h后剖殺小鼠，檢查其腹腔及各臟器有無異常病理變化。

1.2.7 動物免疫試驗 選取20只體質(zhì)量為20～22 g的小鼠，將其隨機分成4組(特異性TF組、普通TF組、僅免疫組、陰性對照組)，每組5只，使用1.2.4中方法對小鼠TF進行定量后，分別將特異性TF與普通TF腹腔接種至小鼠體內(nèi)，劑量為150 μg/只。24 h后，對2組TF處理后的小鼠均免疫SpaA抗原，并以未接種TF的免疫小鼠(標記為僅免疫組)和空白組作為對照，免疫劑量100 μL/只，抗原含量10 μg/只。

1.2.8 間接ELISA法檢測小鼠血清豬丹毒IgG抗體 在接種疫苗后12、21、30 d，分別對小鼠進行眼球采血，參照劉曉波[10]的方法對小鼠血清進行豬丹毒IgG抗體檢測。首先將原核表達并純化后的SpaA蛋白以100 ng/孔包被于96孔酶標板，于4 ℃包被24 h后，用PBST洗滌2次。然后每孔加入110 μL的封閉液，于37 ℃條件下封閉1 h后，再于37 ℃干燥2 h，用加干燥劑的封口袋進行封裝，4 ℃保存。最后進行間接ELISA法檢測，將所有試劑材料室溫回溫后，每孔加入100 μL用血清稀釋液稀釋的待檢血清(1∶100稀釋)，37 ℃孵育30 min；每孔加入250 μL的PBST，洗滌4次，輕拍干，每孔加入100 μL的辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠酶標二抗(1∶1 000稀釋)，37 ℃孵育30 min；每孔加入250 μL的PBST，洗滌4次，輕拍干，每孔加入50 μL的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入50 μL的終止液(0.6 mol/L H2SO4)，終止反應(yīng)；待冷卻至室溫后，在450 nm波長下測量吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 SpaA蛋白的表達及純化

如圖1所示，大腸桿菌BL21(DE3)-SpaA成功表達出分子質(zhì)量為60 ku，能夠可溶性表達的SpaA蛋白。用Ni2+親和層析法對上清液進行純化后，得到了純化的SpaA蛋白。

1：SpaA全菌；2：SpaA上清；3：SpaA流穿液；

2.2 小鼠TF的質(zhì)量濃度

小鼠TF為透明液體，呈淡黃色。利用ELISA Calc軟件分析得BSA標準蛋白曲線如圖2所示，標準品的直線回歸方程為：Y=0.190 91+1.102 05X(r>0.99)。利用上述標準品的直線回歸方程，經(jīng)計算得出，小鼠特異性TF的質(zhì)量濃度為2.56 mg/mL，小鼠普通TF的質(zhì)量濃度為2.40 mg/mL。

圖2 BSA標準蛋白曲線

2.3 小鼠TF的無菌檢測和安全性試驗結(jié)果

將小鼠特異性TF和普通TF接種于巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h后未見有細菌生長。將小鼠特異性TF、普通TF和等量的生理鹽水分別接種至小鼠腹腔，然后對小鼠生理活動進行觀察發(fā)現(xiàn)，2種TF處理組與生理鹽水組的小鼠相比，無明顯異常的生理現(xiàn)象。48 h后剖殺小鼠檢查，各項器官無明顯病變情況，說明制得的小鼠TF安全無毒。

2.4 小鼠血清豬丹毒IgG抗體檢測結(jié)果

在接種SpaA疫苗后12、21、30 d，對小鼠進行眼球采血并進行豬丹毒IgG抗體檢測，如圖3所示，小鼠血清豬丹毒IgG抗體水平變化曲線中，小鼠特異性TF組和普通TF組的抗體IgG水平在免疫后21、30 d均高于僅免疫組，且差異顯著(P<0.05)，2個TF處理組在免疫21 d后能夠維持較高的抗體水平，且2種TF處理組內(nèi)21 d和30 d的抗體水平經(jīng)t檢驗無明顯差異(P>0.05)，說明TF能誘導SpaA疫苗快速產(chǎn)生抗體，提高SpaA疫苗的免疫效果，但與TF的特異性關(guān)系不大。

圖3 小鼠豬丹毒抗體水平變化曲線Fig.3 Curve of mouse erysipelas antibody levels

3 結(jié)論與討論

早期研究證實，動物脾臟中含有大量的轉(zhuǎn)移因子，本研究以小鼠脾臟為原始材料，制得豬丹毒特異性TF和普通TF，探究了TF對豬丹毒SpaA疫苗的免疫增強效果，并比較了兩者之間的免疫增強活性，結(jié)果表明，2種TF與豬丹毒SpaA疫苗聯(lián)合使用后可明顯提高小鼠的抗體水平，且與TF的特異性關(guān)系不大。TF能夠增強豬丹毒SpaA疫苗產(chǎn)生的抗體效價，提高機體抗豬丹毒桿菌感染的能力。特異性TF是指動物感染某種特定抗原后產(chǎn)生針對該抗原特定活性的核酸，在本研究中，豬丹毒SpaA特異性TF與普通TF在提高機體免疫效果上沒有表現(xiàn)出明顯差異，可能與接種特異性TF的劑量和頻率過低以及機體的特異性免疫應(yīng)答能力不足有關(guān)。

基因工程亞單位疫苗是20世紀80年代出現(xiàn)的一種新型疫苗，由于其具有成本低、安全性極高、無需滅活等優(yōu)點成為疫苗研發(fā)的熱點，但其主要的不足之處是免疫原性較低，需要合適的佐劑與之搭配才能產(chǎn)生較好的免疫效果，而TF恰好能充當這一重要角色，即TF作為免疫激活劑進入機體后，使造血系統(tǒng)在短期內(nèi)產(chǎn)生大量白細胞的同時活化淋巴細胞，促進T淋巴細胞生長和分裂，從而能夠顯著提高機體的細胞免疫水平，縮短機體免疫應(yīng)答期，促使機體快速產(chǎn)生抗體[11]。TF作為一種新型的免疫制劑，已被證實對活疫苗和油乳劑滅活苗具有免疫增強作用[12-14]，而在基因工程亞單位疫苗的免疫效果上研究甚少。本研究為我國研制高效的豬丹毒基因工程亞單位疫苗提供了一種新思路。

TF具有廣泛的免疫學調(diào)節(jié)活性，且其作用不受動物種屬的限制，即豬的TF能將其免疫活性轉(zhuǎn)移給犬、雞、鼠和人，在獸醫(yī)臨床上已有許多相關(guān)報道[15]。我國肉禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達，而動物的脾臟在屠宰中一般被廢棄，因此，將其利用開發(fā)動物TF產(chǎn)品具有廣闊的市場前景，TF也將發(fā)揮其巨大的功效。