王飛清，李艷菊，陶奕汐，楊華，黃璜，王琨，劉洋

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗科，貴州 貴陽 550001；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，貴州 貴陽 550004）

衰老是機(jī)體在生命活動過程中一種漸進(jìn)性的組織、器官退行性改變，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多個衰老基因的異常調(diào)控。目前研究認(rèn)為，衰老的病理生理學(xué)機(jī)制主要是隨著年齡增長導(dǎo)致機(jī)體損傷的累積所致[1-2]。SIRT1是一種長壽基因，該基因的缺失將導(dǎo)致機(jī)體提前衰老，其參與大量與衰老相關(guān)的生理病理過程[3]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1具有修復(fù)細(xì)胞的DNA 損傷、延長壽命、抗氧化等作用，在氧化應(yīng)激條件下維持細(xì)胞存活并達(dá)到延長細(xì)胞壽命的效果[4-5]。機(jī)體中卵巢是較早發(fā)生衰老的器官之一，有研究發(fā)現(xiàn)卵泡閉鎖是卵巢功能減退的的直接因素，在該過程中卵巢細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用[6]。本實驗復(fù)制了自然衰老雌鼠模型，通過觀察雌鼠體重、氧化水平、性激素水平的變化，并進(jìn)一步檢測卵巢SIRT1基因表達(dá)情況，解析SIRT1在卵巢功能中的作用。這將為緩解雌性卵巢衰老提出新的思路和方法，為臨床卵巢功能保護(hù)和生殖能力改善的藥物開發(fā)提供有實用價值的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 30 只5 周清潔級SD 雌性大鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，批號為[SCXK（黔）2012-0001]）。

1.1.2 主要儀器和試劑 T5000Y 型電子天平（美國雙杰兄弟有限公司常熟雙杰測試儀器廠），F(xiàn)A1204B分析天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司），Olympus 雙目光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會社），TGL-16M 高速臺式冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），-80℃冰箱（日本Sanyo 公司）。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、總抗氧化能力（total-anti-oxidation capacity,T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所），SIRT1 抗體（武漢博士德生物工程有限公司），促黃體激素（luteotropic hormone,LH）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）、雌二醇（Estradiol,E2）試劑盒（上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司），實時熒光定量聚合酶鏈反 應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）（北京全式金生物技術(shù)有限公司），Trizol試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。引物序列由Primer 3 設(shè)計，上海英俊公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物處理 雌鼠自由飲用自來水和飼料，根據(jù)醫(yī)用實驗動物學(xué)顯示[7]，大鼠在4 周相當(dāng)于3 ～5 歲，12 周相當(dāng)于10 ～12 歲，24 周相當(dāng)于18 ～20 歲，48 周 相當(dāng)于35 ～40 歲，72 周相當(dāng)于50 ～55 歲，72 周確定為大鼠老年期。因此本實驗將雌鼠分為6、12、24、48 及72 周飼養(yǎng)，于不同時間段用10%水合氯醛麻醉，股動脈取血處死6 只雌鼠。取出卵巢剔除臟器周圍脂肪和結(jié)締組織，濾紙吸干表面血液，將一側(cè)卵巢迅速分裝至-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?，另一?cè)卵巢用多聚甲醛溶液固定。

1.2.2 體重測量 每3天早上（8：00 ～10：00）用電子天平對雌鼠進(jìn)行稱重并記錄。

1.2.3 氧化水平檢測 股動脈取血，3 500 r/min 離心10 min 分裝血清低溫保存?zhèn)溆谩２捎枚虼趸郊姿岱z測GSH-Px 活性；采用Fe3+還原法檢測T-AOC，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟完成實驗。

1.2.4 性激素檢測 股動脈取血，用黃色分離膠促凝管收集血液8 ～10ml，3500r/min 離心10min，分離血清于Epp 管中分裝，放于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。血清?7℃電熱恒溫水浴鍋中解凍，采用ELISA 法檢測血清中的LH、FSH、E2水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟完成實驗。

1.2.5 qRT-PCR 檢測卵巢組織中SIRT1 mRNA 表達(dá) 取1 g 卵巢組織加入Trizol 試劑，根據(jù)試劑盒說明書操作提取卵巢組織總RNA，進(jìn)行基因片段擴(kuò)增并定量。cDNA 反應(yīng)體系：總RNA 樣品為2.5 μl，Random primer 1 μl，2×ES Reaction Mix 10 μl，Enzyme Mix 1 μl，gDNA Remover 1 μl，加無酶水至總體積20 μl。PCR 反應(yīng)體系：各PCR 反應(yīng)管中所加模板RNA 的量約為1.8 μl，正反向引物各0.5 μl，Green qPCR Super Mix 10 μl，加無酶水至總體積20 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，45℃退火15 s，72℃ 延伸10 s，共45 個循環(huán)。SIRT1PCR 擴(kuò)增結(jié)果通過PCR 儀記錄的Ct 值對起始模板相對定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 免疫組織化學(xué)法檢測卵巢組織SIRT1 蛋白 處死雌鼠后，迅速取其一側(cè)卵巢，立即放入10%中性甲醛固定液中固定，待固定液浸透后，用鋒利的刀片取大小1 mm×1 mm×1 mm 左右的卵巢組織，石蠟包埋，常規(guī)切片，免疫組織化學(xué)法檢測卵巢組織SIRT1 蛋白表達(dá)情況。SIRT1 蛋白定位于細(xì)胞漿中，陽性細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色，不顯棕黃色者為陰性細(xì)胞。在高倍鏡下，每張切片隨機(jī)取5 個視野，計算每個視野下100 個細(xì)胞中陽性細(xì)胞百分比（陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）。

1.2.7 觀察卵巢組織病理形態(tài) 處死雌鼠后，迅速取下一側(cè)卵巢，經(jīng)多聚甲醛溶液固定3d 后，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色。光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織結(jié)構(gòu)有無形態(tài)學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點雌鼠體重變化

雌鼠體重6、12、24、48 及72 周分別為（178.167± 11.957）、（236.833±14.580）、（303.667±13.171）、（334.850±10.504）及（346.500±5.541）g，隨著時間的延長，雌鼠體重逐漸增加（F=223.470，P=0.000），除48 與72 周比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其他時間點兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各時間點大鼠體重變化趨勢 （n =6，±s）

2.2 不同時間點雌鼠氧化水平變化

雌 鼠 血 清GSH-Px 在6、12、24、48 及72 周表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.471，P=0.000），6、12 及24 周比較，雌鼠血清GSH-Px 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），48和72周雌鼠血清GSH-Px較6、12 及24 周下降，72 周雌鼠血清GSH-Px 與48 周比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

雌鼠血清T-AOC 在6、12、24、48 及72 周表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.518，P=0.001），6、12 及24 周比較，雌鼠血清T-AOC 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），48 和72 周雌鼠血清T-AOC 下降較6、12及24 周（P＜0.05），且12 與48 周比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），72 周雌鼠血清T-AOC 與6、12 及24 周比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 不同時間點雌鼠性激素變化

雌鼠血清FSH 和LH 在6、12、24、48 及72 周表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=73.421 和28.503，均P=0.000），6、12 及24 周比較，雌鼠血清FSH 和LH 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），48 和72 周較6、12及24 周升高（P＜0.05），且48 與72 周比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 不同時間段雌鼠血清GSH-Px 和T-AOC 比較 （n =6，u/ml，±s）

表2 不同時間段雌鼠血清GSH-Px 和T-AOC 比較 （n =6，u/ml，±s）

注：1）與48 周比較，P＜0.05；2）與6、12 及24 周比較，P＜0.05

時間 GSH-Px T-AOC 6 周 1 147.817±127.535 19.583±1.876 12 周 1 106.050±112.249 20.500±2.1271）24 周 1 180.017±109.772 19.367±2.351 48 周 922.983±100.1872） 17.533±1.226 72 周 714.150±87.4601）2） 15.783±1.1392）

雌鼠血清E2在6、12、24、48 及72 周表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.579，P=0.000），6、12 及24 周雌鼠血清E2逐漸升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），48 和72 周雌鼠血清E2逐漸降低，48 周與12 和24 周比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），72 周與各組比較，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 不同時間點雌鼠卵巢SIRT1 mRNA 和蛋白水平變化

雌鼠 卵 巢SIRT1 mRNA 在6、12、24、48 及72周表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=56.271，P= 0.000），雌鼠卵巢SIRT1mRNA 逐漸降低，24 與6 周比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），48 和72 周與各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

雌鼠卵巢SIRT1 蛋白在6、12、24、48 及72 周表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.556，P= 0.001），48 周與6 和12 周比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），72 周與6、12 和24 周比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表4）。免疫組織化學(xué)結(jié)果見圖2。

表3 不同時間點雌鼠血清性激素水平比較 （n =6，±s）

表3 不同時間點雌鼠血清性激素水平比較 （n =6，±s）

注：1）與48 周比較，P ＜0.05；2）與6、12 及24 周比較，P ＜0.05

時間 FSH/（IU/L） LH/（u/ml） E2/（ng/L）6 周 10.367±1.447 2.917±0.376 135.371±18.284 12 周 10.200±0.815 3.067±0.339 141.765±13.4231）24 周 10.283±1.375 2.633±0.301 144.473±15.351）48 周 14.933±1.1222） 3.667±0.5392） 120.069±17.885 72 周 21.433±1.9761）2） 5.217±0.6941）2） 69.374±14.4311）2）

表4 不同時間點雌鼠SIRT1 mRNA 和蛋白水平比較 （n =6，±s）

表4 不同時間點雌鼠SIRT1 mRNA 和蛋白水平比較 （n =6，±s）

注：1）與6 周比較，P ＜0.05；2）與12 周比較，P ＜0.05； 3）與24 周比較，P ＜0.05

時間 SIRT1 mRNA SIRT1 蛋白6 周 0.973±0.058 49.167±8.110 12 周 0.952±0.030 51.333±7.789 24 周 0.913±0.0671） 44.833±4.977 48 周 0.767±0.0961）2）3） 39.333±5.3911）2）72 周 0.614±0.0471）2）3） 34.833±5.7761）2）3）

圖2 不同時間點雌鼠卵巢SIRT1 表達(dá)水平 （HE×200）

2.5 不同時間點雌鼠卵巢組織病理變化

各時間點雌鼠卵巢外觀未見萎縮、水腫等病變，卵巢組織色澤正常質(zhì)軟。光學(xué)顯微鏡下6、12 及24 周卵巢組織結(jié)構(gòu)形態(tài)未見明顯病變，可見各級卵泡，卵泡顆粒細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，可見清晰卵丘等結(jié)構(gòu)。隨著時間延長，48 周雌鼠卵巢組織與6、12 及24 周比較，閉鎖卵泡增多，黃體和各級發(fā)育卵泡減少，組織間隙可見少量脂滴。72 周雌鼠卵巢組織閉鎖卵泡明顯增多，黃體和各級發(fā)育卵泡明顯減少，卵泡顆粒細(xì)胞減少，排列松散，組織間隙可見大量脂滴，呈現(xiàn)明顯衰老的特征。見圖3。

圖3 不同時間點雌鼠卵巢組織病理變化 （HE×200）

3 討論

衰老是生命運動中不可避免的過程，只是不同個體在不同時期衰老的進(jìn)程并不相同，環(huán)境污染、生活工作壓力增加以及生育政策等加速女性的衰老。研究表明，體重增加導(dǎo)致肥胖可影響包括心血管疾病、糖尿病、癌癥、代謝紊亂以及生殖功能衰退的風(fēng)險[8-9]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隨著機(jī)體衰老，體重增加對女性生殖功能有著不利的影響[10]。根據(jù)動物學(xué)實試驗顯示，48周雌鼠進(jìn)入衰老進(jìn)程，且72 周確定為大鼠老年期。本實驗結(jié)果顯示，隨著飼養(yǎng)時間的延長，雌鼠體重逐漸增加，且48 和72 周雌鼠體重高于其他各組。縱觀近一個世紀(jì)的衰老研究歷程，產(chǎn)生許多有關(guān)衰老分子機(jī)制的學(xué)說，其中，包括經(jīng)典的氧自由基學(xué)說等[11-12]。本實驗結(jié)果顯示，隨著飼養(yǎng)時間的延長，雌鼠血清GSH-Px和T-AOC 水平降低，可推斷在機(jī)體衰老過程中，機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生了明顯變化。

卵巢衰老是自然的生理過程，主要原因在于卵泡的不斷消耗引起卵巢儲備功能的下降。其機(jī)制是卵巢內(nèi)微環(huán)境的改變，導(dǎo)致卵泡質(zhì)量下降，進(jìn)一步出現(xiàn)卵巢分泌E2水平下降等一系列表現(xiàn)[13]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，雌激素是女性青春魅力的源泉，其含量能促進(jìn)女性卵泡發(fā)育、成熟、排卵，乳腺等女性生殖器官的生長和發(fā)育[14-15]。本實驗結(jié)果顯示，隨著時間的延長，雌鼠血清E2逐漸降低，此時性腺軸垂體負(fù)反饋調(diào)節(jié)FSH 和LH 水平升高。同時本實驗卵巢病理結(jié)果進(jìn)一步顯示，雌鼠卵巢組織隨著時間延長閉鎖卵泡明顯增多，黃體和各級發(fā)育卵泡水平減少，卵泡顆粒細(xì)胞減少，排列松散，組織間隙可見大量脂滴，呈現(xiàn)明顯衰老的特征。

衰老是生物機(jī)體必然發(fā)生的復(fù)雜生命現(xiàn)象，整體表現(xiàn)為代謝能力下降、適應(yīng)能力減退等。近年來抗衰老 基因SIRT1已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點，SIRT1是調(diào)節(jié)生物體衰老進(jìn)程的一個重要基因，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、代謝和老化過程中發(fā)揮積極作用[16-17]。SIRT1的特殊結(jié)構(gòu)決定它的生物學(xué)功能，包括參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA 復(fù)制、損傷修復(fù)和代謝調(diào)控等一系列的細(xì)胞活動，其依賴NAD+的組蛋白去乙?；窼IRT1在調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、分化與衰老等方面都有著關(guān)鍵的影響與作用。SIRT1還與年齡有關(guān)的活性氧之間有極重要的關(guān)系，兩者都依賴于線粒體的代謝來維持其高濃度而發(fā)揮作用。國外研究報道，SIRT1基因缺陷小鼠不能生育，同時表現(xiàn)出卵泡發(fā)育成熟受抑制以及性成熟推遲[18-19]。本實驗結(jié)果顯示，隨著時間延長雌鼠卵巢SIRT1基因和蛋白水平降低，同時性激素分泌明顯異常，卵巢呈現(xiàn)明顯衰老特征，表明SIRT1在調(diào)控哺乳動物生殖系統(tǒng)的生物學(xué)功能方面有著不可或缺的作用。

本實驗成功復(fù)制自然衰老雌鼠模型，表現(xiàn)在衰老雌鼠體重明顯增加，抗氧化水平降低加速機(jī)體的衰老，卵巢呈現(xiàn)明顯衰老癥狀誘發(fā)性激素的異常，且抗衰老基因SIRT1在衰老雌鼠卵巢表達(dá)降低，推斷SIRT1基因在衰老大鼠卵巢生殖功能異常中發(fā)揮重要作用。未來臨床利用相關(guān)技術(shù)激活SIRT1基因活化是否成為延緩卵巢早衰靶點有待進(jìn)一步研究。