龔永謙，羅興谷，唐洪波

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，湖南 衡陽 421001）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是中國南方及東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，是指發(fā)生在鼻咽腔頂部與側(cè)壁的惡性腫瘤[1]。鼻咽癌的發(fā)病因素還不明確，除了遺傳等因素外，還與環(huán)境、生活習(xí)慣等因素息息相關(guān)。Raf 激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein,RKIP）屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白的一種，是NF-κB 信號(hào)通路的內(nèi)源性抑制子。近來研究發(fā)現(xiàn)[2]，RKIP 在NPC 組織中明顯下調(diào)。P27 蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白激酶抑制蛋白，可參與細(xì)胞周期調(diào)控[3]。研究顯示，P27 蛋白表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)[4]。本研究探討RKIP、P27 蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)及與鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年3月—2016年1月南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科收集的鼻咽癌黏膜組織76 例（病例組）和正常鼻咽組織30 例（對照組）。病例組：男性49 例，女性27 例；年齡42 ～78 歲，平均（59.3±11.5）歲；臨床分期：Ⅰ期鼻咽癌患者12 例、Ⅱ期鼻咽癌患者20 例、Ⅲ期鼻咽癌患者30 例、Ⅳ期鼻咽癌患者14 例；經(jīng)檢查出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50 例患者。對照組：男性23例，女性7 例；年齡44 ～75 歲，平均（57.0±12.0）歲。 兩組的年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（P＞ 0.05）。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①鼻咽癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)病理學(xué)結(jié)果；②患者年齡＜80 歲；③鼻咽癌組織在獲取標(biāo)本前，患者無放化療病史；④正常鼻咽黏膜組織來源于因其他外科手術(shù)獲取的患者；⑤本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①轉(zhuǎn)移性鼻咽癌；②既往具有放化療病史；③患者臨床數(shù)據(jù)、基礎(chǔ)資料不完整。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測兩組標(biāo)本中RKIP、P27 蛋白的表達(dá)，將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化處理，使用SP 法檢測RKIP 的表達(dá)，使用3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，3%牛血清清蛋白封閉1 h 處理，然后分別滴加1 ∶100 山羊抗人RKIP多抗和鼠抗人P27 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司），4℃過夜。沖洗后滴加生物素標(biāo)記的驢抗兔IgG 工作液（武漢艾美捷科技有限公司），室溫孵育1 h，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，孵育1 h。DAB 顯色處理，蘇木精復(fù)染，脫色后顯微鏡下觀察。設(shè)計(jì)空白對照，以PBS 代替一抗，其他操作步驟相同。

1.4 免疫組織化學(xué)染色判斷標(biāo)準(zhǔn)

細(xì) 胞 質(zhì)、細(xì) 胞 膜 中 定 位RKIP、P27 蛋 白的陽性表達(dá)，陽性表達(dá)均表現(xiàn)為黃色甚至棕黃色，按照染色強(qiáng)度劃分：無色（0 分）、淡黃色（1 分）、棕 黃 色（2 分）、褐 色 或 者 黑色（3分）；按照染色陽性的細(xì)胞比例劃分：≤10% （1 分）、11%～50%（2 分）、51%～75%（3 分）、＞75% （4 分）；染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞比例評分之積＜3 分判斷為陰性、≥3 分判斷為陽性。染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞比例評分之積＜3 分（-）；染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞比例評分之積3 ～5 分（+）；染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞比例評分之積6 ～9 分（++）；染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞比例評分之積＞9 分（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組RKIP、P27 蛋白的表達(dá)率比較

兩組RKIP 蛋白和P27 蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），病例組的RKIP 蛋白陽性表達(dá)率低于對照組，病例組的P27 蛋白陽性表達(dá)率高于對照組（見表1、2）。RKIP 蛋白在正常鼻咽組織中呈陽性表達(dá)，在鼻咽癌組織中呈陰性表達(dá)；P27 蛋白在正常鼻咽組織中呈陰性表達(dá)，在鼻咽癌組織中呈陽性表達(dá)（見圖1、2）。

表1 兩組RKIP 蛋白的表達(dá)率比較

表2 兩組P27 蛋白的表達(dá)率比較

圖1 RKIP 蛋白的表達(dá) （SP×400）

圖2 P27 蛋白的表達(dá) （SP×400）

2.2 兩組RKIP、P27 蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者病灶組織中的RKIP 蛋白陽性表達(dá)率低于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；RKIP 蛋白陽性表達(dá)與患者年齡、性別、T 分級無關(guān)（P＞0.05）。見表3。

發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者病灶組織中的P27 蛋白陽性表達(dá)率高于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；P27 蛋白陽性表達(dá)與患者年齡、性別、T 分級無關(guān)（P＞0.05）。見表4。

表3 患者臨床病理學(xué)特征與鼻咽癌組織中RKIP 蛋白 表達(dá)的關(guān)系 例（%）

表4 患者臨床病理學(xué)特征與鼻咽癌組織中 P27 蛋白表達(dá)的關(guān)系

續(xù)表4

3 討論

NPC 是指起源于鼻咽黏膜上皮和腺體的惡性腫瘤。世界衛(wèi)生組織調(diào)查報(bào)道，全球有80%的鼻咽癌患者在中國[5]。近年來鼻咽癌在我國的發(fā)病趨勢逐漸上升。隨著鼻咽癌診斷、治療水平的不斷提高，中晚期鼻咽癌的療效得到提高，但是患者的5年生存率仍然為70%[6]。針對細(xì)胞信號(hào)途徑的分子靶向藥物開創(chuàng)了腫瘤治療的新時(shí)代，探索有效的腫瘤診治靶點(diǎn)具有重要意義。

研究鼻咽癌相關(guān)基因是揭示鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的重要基礎(chǔ)。RKIP 是一種轉(zhuǎn)移抑制基因，作為調(diào)控多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中心蛋白，參與G 蛋白偶聯(lián)受體和NF-κB 等信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)[7]。RKIP 是NF-κB 信號(hào)通路的內(nèi)源性抑制子，通過抑制IκB 激酶的活化來發(fā)揮NF-κB 信號(hào)通路負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。侵襲、轉(zhuǎn)移是鼻咽癌的主要生物學(xué)特征，也是影響患者預(yù)后的最重要的原因。研究顯示[8-9]，RKIP 具有促進(jìn)凋亡，抑制細(xì)胞生長和腫瘤轉(zhuǎn)移的重要功能。研究發(fā)現(xiàn)[10]，RKIP 在多種癌癥例如前列腺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。然而，RKIP 在NPC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制仍然不清楚。本研究數(shù)據(jù)表明，病例組的RKIP 蛋白陽性表達(dá)率低于對照組；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者病灶組織中的RKIP 蛋白陽性表達(dá)率低于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者；結(jié)果表明RKIP 蛋白在鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起到了重要的促進(jìn)作用。

細(xì)胞周期是生命活動(dòng)的基本過程，腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期密切相關(guān)。RKIP 可以加速6-10B細(xì)胞越過G0/G1 期。因此筆者猜測，RKIP 通過影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)揮促進(jìn)凋亡，抑制細(xì)胞生長和腫瘤轉(zhuǎn)移的重要功能。P27 蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的非特異性的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）。主要功能是作為細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK）抑制因子參與細(xì)胞周期調(diào)控[11]。目前已有關(guān)于P27 蛋白與鼻咽癌臨床參數(shù)的研究，但是尚無統(tǒng)一的定論，因此本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，探索鼻咽癌組織中RKIP 蛋白低表達(dá)與P27 蛋白是否相關(guān)。P27 作為抑癌基因的一種，是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，能抑制各種細(xì)胞周期蛋白和激酶的活性[12]。實(shí)驗(yàn)證明，P27 蛋白主要通過抑制Cydin-CDKs 復(fù)合物的活性來實(shí)現(xiàn)其對細(xì)胞周期的調(diào)控[13]。一方面P27 蛋白能抑制已被激活的CDK 活性，另一方面P27 蛋白也可以抑制CDK的激活過程，實(shí)現(xiàn)抑癌作用。研究顯示[14]，P27 蛋白在多種癌癥例如胃癌、食管癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中有抑癌作用。本研究結(jié)果顯示，病例組的P27 蛋白陽性表達(dá)率高于對照組；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者病灶組織中的P27 蛋白陽性表達(dá)率高于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者。結(jié)果提示P27 的表達(dá)上升預(yù)示鼻咽癌腫瘤發(fā)生的可能性增加，并可能促進(jìn)鼻咽癌的進(jìn)展。P27 蛋白的異常表達(dá)可以作為評價(jià)鼻咽癌是否轉(zhuǎn)移的一個(gè)指標(biāo)。

綜上所述，鼻咽癌組織中RKIP 蛋白低表達(dá)、P27蛋白高表達(dá)，并且與鼻咽癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。深入研究RKIP、P27 蛋白在鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制，對研發(fā)相應(yīng)的靶向藥物、提高臨床療效及改善鼻咽癌患者預(yù)后具有重要的臨床意義。