封曉榮，陳思宇，張歲龍，黃春春

心血管疾病已成為繼腫瘤之后威脅人們身體健康和生活質(zhì)量的第二大疾病，我國每年心血管病患病率仍處于持續(xù)上升階段，防治心血管疾病已是刻不容緩[1]。心肌纖維化是心血管疾病心肌重構(gòu)的重要機制，而心肌成纖維化細胞的過度增殖和遷移是心肌纖維化形成的重要基礎。因此，研究如何抑制心肌成纖維化細胞增殖和遷移對緩解心肌纖維化和治療心血管疾病具有重要意義。PTEN是一種位于10q23.3染色體上抑癌基因，具有編碼雙重特異性磷酸酶產(chǎn)物的特性，參與細胞增殖、遷移、分化和凋亡等生物學行為，與包括心肌纖維化在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生關系密切[2]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)過度激活可促進心肌纖維化和心肌重構(gòu)，血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）是該系統(tǒng)的重要效應分子，可通過促進細胞外膠原纖維的合成和刺激心肌成纖維細胞增生等發(fā)揮促進心肌間質(zhì)纖維化的作用[3]。大量研究[4-6]顯示，PTEN在肺、腎和肝等纖維化形成過程中發(fā)揮著重要作用。近年來有研究[7]發(fā)現(xiàn)，PTEN與心肌梗死后心臟纖維化過程有關，但其對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖遷移和膠原合成的影響并不完全清楚。因此，本研究通過轉(zhuǎn)染真核表達載體獲得PTEN高表達的心肌成纖維細胞，旨在探討上調(diào)觀察PTEN對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖遷移和膠原合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級SD大鼠，1～3 d齡，購于西安動物實驗中心。脂質(zhì)體2000、pcDNA3.1-PTEN和陰性對照pcDNA3.1載體購于美國Invitrogen公司。AngⅡ和MTT試劑購于美國Sigma公司，胎牛血清購于美國Thermo公司，二甲基亞楓和DMEM培養(yǎng)基購于上海川翔生物公司，PTEN（1:200）特異性一抗購于美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH抗體（1:1000）和二抗（辣根過氧化物酶標記，1:2000）購于美國Santa Cruz公司。細胞周期檢測試劑盒和化學發(fā)光試劑盒購于上海碧云天公司，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原ELISA試劑盒購于晶美公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購于美國Pierce公司。Transwell小室購于美國Corning公司。

1.2 細胞培養(yǎng)取剛出生2 d的SD大鼠，開腔取左心室置于小燒杯中，加入胰蛋白酶制成勻漿。離心后，收集細胞沉淀，加入的DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）獲得細胞懸液，過150目篩網(wǎng)后，接種至含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于飽和濕度、5%CO2和37℃的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)細胞差速貼壁原理，培養(yǎng)1.5 h后，去培養(yǎng)液，附于瓶底的即為心肌成纖維細胞（經(jīng)倒置顯微鏡觀察和免疫組化波形蛋白染色鑒定證實）。加入含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液，待細胞生長至匯合度達85%以上時，加胰蛋白酶消化傳代，收集第3～5代細胞進行實驗。

1.3 分組及處理實驗分為空白對照組、AngⅡ組、AngⅡ+陰性對照（AngⅡ+NC組）和Ang II+PTEN組4組。各組細胞處理分別如下：空白對照組細胞不做任何處理；AngⅡ組細胞以濃度為1×106mol/L AngⅡ處理48 h；AngⅡ+NC組：以脂質(zhì)體2000將pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至細胞后，給予相同濃度的AngⅡ處理48 h；AngⅡ+PTEN組細胞以脂質(zhì)體2000將pcDNA3.1-PTEN轉(zhuǎn)染至細胞后，給予相同濃度的AngⅡ處理48 h。取6孔細胞板，每孔接種100 μl濃度為6×106個/ml細胞懸液，于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜。次日，進行轉(zhuǎn)染。按照上述分組，根據(jù)脂質(zhì)體2000說明書將pcDNA3. 1-PTEN和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至細胞中，轉(zhuǎn)染后6 h。更換培養(yǎng)基，加入AngⅡ處理48 h。收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 PTEN蛋白表達的檢測采用Western blot檢測，加入細胞裂解液提取對照組、AngⅡ組、AngⅡ+PTEN組和AngⅡ+NC組細胞的總蛋白后，以蛋白定量試劑盒進行濃度的定量。取60 μg蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混合后，上SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，半干法轉(zhuǎn)膜后，以封閉液常溫封閉2 h。分別加入一抗（4℃，24 h）和二抗（37℃，1 h）孵育。以化學發(fā)光試劑盒顯影曝光。凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。以PTEN蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值的比值表示PTEN蛋白的相對表達量。

1.5 細胞增殖能力檢測采用MMT法檢測。以每孔100 μl將濃度為5×106個/ml的心肌成纖維細胞懸液平鋪于96孔板上，按照1.3中的分組處理細胞后，每組設6個平行孔，并重復3次。分別在處理24～72 h時間后，加入20 μl濃度5 g/l MTT溶液，反應4 h后，加入二甲基亞楓100 μl震蕩至結(jié)晶體溶解。采用酶標儀檢測各組細胞在450 nm處的吸光度值（OD）。

1.6 細胞周期檢測采用流式細胞儀檢測。收集AngⅡ處理48 h的各組細胞，加胰蛋白消化，制備單細胞懸液。每組設3個重復。嚴格按照細胞周期檢測試劑盒說明書步驟操作，上流式細胞儀檢測對照組、AngⅡ組、AngⅡ+PTEN組和AngⅡ+NC組細胞在G0/G1、S和G2/M期所占的百分比。

1.7 細胞遷移能力檢測采用Transwell小室實驗檢測。取生長良好的對照組、AngⅡ組、AngⅡ+PTEN組和AngⅡ+NC組細胞，以胰酶消化后，制備單細胞懸液，向Transwell上室中加入100 μl濃度為1.0×104個/ml的細胞懸液，以無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)，下室中加入含血清的500 μl培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出小室。輕輕擦去下室內(nèi)的培養(yǎng)液，以PBS洗滌后，甲醇固定和結(jié)晶紫染色后。每張膜選取5個視野，顯微鏡觀察各組的遷移細胞數(shù)，結(jié)果以五個視野細胞數(shù)的平均值表示。

1.8 膠原蛋白含量的檢測ELISA檢測Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的含量。取24孔細胞板，調(diào)整細胞濃度后，以每孔5×105個/ml接種心肌成纖維細胞，培養(yǎng)至細胞融合度為80%左右時，按照1.3中的分組處理細胞。在AngⅡ作用48 h后，收集各組細胞上清液，以ELISA試劑盒檢測各組細胞中Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的含量。

1.9 統(tǒng)計學分析所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料用（±s）表示，多組差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌成纖維細胞中PTEN蛋白的表達Western blot檢測空白對照組、AngⅡ組、AngⅡ+NC組和AngⅡ+PTEN組細胞中PTEN蛋白的相對表達量分別為1.00±0.07、0.48±0.05、0.52±0.06和0.76±0.05，4組細胞中PTEN蛋白的相對表達量整體比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=51.556，P=0.000）（圖1）。與空白對照組相比，AngⅡ組、AngⅡ+NC組和AngⅡ+PTEN組細胞中PTEN蛋白表達水平均降低（P＜0.05），而AngⅡ+PTEN組較AngⅡ組和AngⅡ+NC組升高（P＜0.05），AngⅡ組與AngⅡ+NC組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTEN表達載體成功上調(diào)了AngⅡ下調(diào)的PTEN表達。

2.2 各組心肌成纖維細胞增殖結(jié)果成功上調(diào)PTEN表達后，采用MTT法檢測其對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖的影響（表1）。AngⅡ處理24 h、48 h和72 h后，心肌成纖維細胞的增殖能力較空白對照組升高，而成功上調(diào)PTEN表達后心肌成纖維細胞的增殖受到抑制，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？梢?，上調(diào)PTEN表達可抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖。

2.3 各組心肌成纖維細胞周期的進展流式細胞儀檢測各組細胞的周期變化（表2）。與空白對照組相比，AngⅡ組、AngⅡ+NC組和AngⅡ+PTEN組中G0/G1期細胞比例均降低，而S期和G2/M期細胞比例均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與AngⅡ組相比，AngⅡ+PTEN組中G0/G1期細胞比例均升高，而S期和G2/M期細胞比例降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；AngⅡ+NC組與AngⅡ組比較各時相細胞比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?？梢?，上調(diào)PTEN表達阻斷了AngⅡ誘導心肌成纖維細胞周期進展。

表1 不同時間下各組細胞的OD值（x ±s，n=3）

表2 各組細胞的周期變化（x ±s，n=3）

2.4 各組心肌成纖維細胞遷移結(jié)果采用Transwell小室檢測上調(diào)PTEN表達后對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞遷移的影響（表3）。AngⅡ組、AngⅡ+NC組和AngⅡ+PTEN組細胞遷移細胞數(shù)較空白對照組均升高（P＜0.05），同時，與AngⅡ組相比，AngⅡ+NC組的遷移細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但AngⅡ+PTEN組的遷移細胞數(shù)降低（P＜0.05）。上調(diào)PTEN表達可明顯抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞遷移。

2.5 各組心肌成纖維細胞中Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的含量進一步觀察各組細胞上清液中Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白含量，見表4。經(jīng)AngⅡ處理后，心肌成纖維細胞中Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白含量均升高（P＜0.05）。在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTEN表達載體后再給予AngⅡ處理，降低了細胞中Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白含量（P＜0.05），但轉(zhuǎn)染pcDNA3載體并未影響AngⅡ處理后細胞中Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的含量（P＜0.05）。

表3 各組細胞的遷移細胞數(shù)（x ±s，n=3）

表4 各組細胞中Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的含量（x ±s，n=3）

3 討論

PTEN作為抑癌基因，在多種腫瘤組織中異常低表達或缺失，已被證實與腫瘤如結(jié)直腸癌、乳腺癌和胃癌等發(fā)生與發(fā)展關系密切[8-10]。除腫瘤領域外，學者們還發(fā)現(xiàn)PTEN在多種組織的纖維化過程中發(fā)揮著主要作用。如Parapuram等[11]發(fā)現(xiàn)，皮膚成纖維細胞中PTEN表達的缺失促進了皮膚纖維化過程；Zhou等[12]指出，抑制PTEN活性加重了缺血再灌注誘導的急性腎損傷小鼠的腎纖維化。Li等[13]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PTEN的表達可減少α-平滑肌肌動蛋白的分泌，進而阻止肝纖維化的進展。在缺氧條件下心肌成纖維細胞PTEN表達逐漸減少，與缺氧誘導的心肌成纖維細胞增殖密切相關[14]。近年來有研究[7]發(fā)現(xiàn)，PTEN可能參與心肌梗死后心臟纖維化過程，但其對促纖維化因子AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖遷移和膠原合成的影響并不完全清楚。

有報道[15,16]顯示，AngⅡ處理后，血管平滑肌細胞在G0/G1百分比降低，在S和G2/M期百分比升高，細胞增殖和遷移能力增強；此外，AngⅡ可使腎小管上皮細胞阻滯在G2/M期，加快腎纖維化過程[17]。另外有報道稱[18]，上調(diào)PTEN表達后，口腔鱗癌細胞增殖和侵襲能力明顯減弱，同時G0/G1期的細胞數(shù)比例明顯增加，而S期和G2/M期的細胞數(shù)比例明顯減少。為了探討心機纖維化過程中，PTEN對促纖維化因子AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖遷移的影響，本研究首先通過AngⅡ處理體外培養(yǎng)的心肌成纖維細胞，構(gòu)建心肌纖維化細胞模型。采用Western blot檢測心肌成纖維細胞中PTEN蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能夠引起心肌成纖維細胞中PTEN表達降低，以脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PTEN真核表達載體后，成功上調(diào)了PTEN表達。MTT和Transwell小室檢測上調(diào)PTEN表達對心肌成纖維細胞增殖和遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ處理后，心肌成纖維細胞增殖和遷移能力明顯增強。這一結(jié)果與ZOU等[19]研究發(fā)現(xiàn)的AngⅡ通過激活自噬誘導CFs增殖及遷移結(jié)果相吻合。進一步采用流式細胞儀檢測細胞的周期變化發(fā)現(xiàn)，AngⅡ處理后，心肌成纖維細胞在G0/G1期比例降低，S期和G2/M期比例升高；成功上調(diào)PTEN后逆轉(zhuǎn)了AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖，周期進展和細胞遷移。提示，上調(diào)PTEN可能通過阻斷AngⅡ促使心肌成纖維細胞從G0/G1進入S期的進展進而抑制細胞增殖。除心肌成纖維細胞過度增殖外，膠原蛋白的大量合成也是心肌纖維化的重要病理特征。本研究進一步檢測發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PTEN表達后，可明顯遏制AngⅡ引起的膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ含量的升高。這一結(jié)果反向印證了韓景舒等發(fā)現(xiàn)的PTEN低表達可上調(diào)膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ表達的結(jié)果。提示，PTEN可能通過促進膠原蛋白的降解，抑制了心肌纖維化的進程。

綜上所述，PTEN在AngⅡ誘導心肌成纖維化細胞中表達下降，上調(diào)其表達可抑制Ang II誘導心肌成纖維化細胞增殖遷移和膠原蛋白的合成。這一結(jié)果豐富了心肌纖維化的分子機制，為以PTEN為靶點的心肌纖維化和心血管疾病的治療提供了參考依據(jù)。本研究初步探討PTEN在心肌成纖維細胞生長過程中的調(diào)控作用，但其PTEN抑制成纖維化增殖、遷移和膠原蛋白合成的具體機制還有待更深入的研究。