孫婷婷， 魏雅平， 程 紅， 馮 慧， 王 祥， 褚天亮， 葉明君， 俞 浩

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

滁菊(Dendranthemamorifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju)為菊科植物菊的干燥頭狀花序，滁菊因栽培歷史悠久、品質(zhì)優(yōu)良而馳名全國(guó)，其藥用價(jià)值位列四大白菊之首，為著名道地藥材[1]。當(dāng)前，滁菊產(chǎn)業(yè)已成為滁州市地方支柱產(chǎn)業(yè)，對(duì)帶動(dòng)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收致富有重大意義?，F(xiàn)代研究表明，滁菊富含黃酮[2]、酚酸[3]、揮發(fā)油[4]、氨基酸和微量元素等多種成分[5]，具有抗氧化[6]、抗病毒[7]、鎮(zhèn)痛[8]、降壓[9]、保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷[10]等多種功能。本試驗(yàn)利用HPLC法同時(shí)測(cè)定不同栽培區(qū)域中滁菊中綠原酸[11]、木犀草苷[12]、異綠原酸A、異綠原酸C[13]、黃芩苷[14]、槲皮素[15]、木犀草素[16]、芹菜素[17]等8 種成分的濃度，以期為滁菊藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

高效液相色譜儀(日本島津有限公司)；AP-01P真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵(鄭州英峪予華儀器有限公司)；CP225D準(zhǔn)微量天平(德國(guó)賽多利斯公司)；DHG-9101-2SA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；TZ520130204離心機(jī)(湖南易達(dá)京華儀器有限公司)。

滁菊藥材樣品分別采自滁州市全椒縣復(fù)興鄉(xiāng)復(fù)興村、周崗鄉(xiāng)大莊村、滁州市南譙區(qū)城郊鄉(xiāng)城西村中郢、南譙區(qū)施集鎮(zhèn)明張村、南譙區(qū)大柳鎮(zhèn)廣衛(wèi)村、中國(guó)滁州菊花博覽園，及安徽科技學(xué)院中藥科技園等7個(gè)不同栽培區(qū)域中。綠原酸(含量≥98%，批號(hào)：wkq16052705),黃芩苷(含量≥98%，批號(hào)：wkq16070503),木犀草素(含量≥98%，批號(hào)：wkq16051201)均購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；槲皮素(含量≥98.5%，批號(hào)：J1226035)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芹菜素(含量≥98.20%，批號(hào)：15032610)，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；異綠原酸A(含量≥98%，批號(hào)：Y24N8Y49009),木犀草苷(HPLC≥98%，批號(hào)：Y05D8H49919),異綠原酸C(含量≥98%，批號(hào)：P25J6F1794)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。甲醇購(gòu)于安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；乙?色譜純)購(gòu)于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；其他試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(表1)；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫條件

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱定綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，經(jīng)70%甲醇溶解后，定容于10 mL容量瓶中，超聲20 min，得出0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。分別吸取不同體積的溶液制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4 ℃冰箱保存。各標(biāo)準(zhǔn)品濃度見(jiàn)表2。

表2 混合標(biāo)準(zhǔn)品各成分濃度

1.2.3 滁菊檢測(cè)樣品溶液的制備 取不同栽培區(qū)域滁菊，干燥后粉碎，過(guò)一號(hào)篩，得滁菊粗粉。精密稱定滁菊粗粉0.25 g，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱定重量。超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)40 min，靜置冷卻后再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，置4 ℃冰箱保存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

1.3.1 線性關(guān)系考察 取1.2.2節(jié)下配制的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣3、6、9、12、15 μL，按1.2.1節(jié)下方法測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，繪制各標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 專屬性考察 分別取1.2.2節(jié)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和1.2.3節(jié)下滁菊樣品溶液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液各成分保留時(shí)間、滁菊樣品溶液中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素的保留時(shí)間及各峰分離程度(圖1)。

1.3.3 精密度測(cè)定 取1.2.2節(jié)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，按照1.2.1節(jié)下色譜條件進(jìn)行分析，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，以綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素吸收峰峰面積積分值，計(jì)算RSD值分別為1.91%、1.78%、2.56%、0.97%、0.67%、0.64%、1.09%、2.40%。

1.3.4 穩(wěn)定性測(cè)定 取1.2.3節(jié)下中國(guó)滁州菊花博覽園檢測(cè)樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，以綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素的峰面積，計(jì)算RSD值分別為0.31%、0.61%、1.64%、0.66%、1.66%、0.23%、0.29%、2.10%。

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取中國(guó)滁州菊花博覽園樣品6份，精密稱定0.25 g，按1.2.3節(jié)下制備檢測(cè)樣品溶液，按1.2.1節(jié)下色譜條件進(jìn)樣，以綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面積，計(jì)算RSD值分別為1.20%，1.94%，0.52%，2.01%，1.70%，1.26%，1.16%，1.31%。

1.3.6 加樣回收率測(cè)定 精密稱定已知含量的滁菊藥材粉末6 份，每份約0.125 g，分別精密加入已知量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.3節(jié)下操作制備檢測(cè)樣品溶液，進(jìn)樣10 μL，計(jì)算平均加樣回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

建立上述HPLC檢測(cè)方法，同時(shí)測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8種成分峰面積，分別建立8條線性關(guān)系(表3)。在相應(yīng)線性范圍內(nèi)，其相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，結(jié)果表明建立的線性關(guān)系良好，可用于滁菊檢測(cè)樣品溶液中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8種成分的定量檢測(cè)。

測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和滁菊樣品溶液中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素的保留時(shí)間及各峰分離程度，如下圖所示，結(jié)果表明混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中與滁菊檢測(cè)樣品溶液中各成分保留時(shí)間基本一致，各峰分離程度良好，表明該試驗(yàn)方法專屬性良好，可用于滁菊中上述8種成分同時(shí)檢測(cè)。

表3 線性關(guān)系

圖1 混合對(duì)照品(A)與滁菊樣品(B)HPLC圖

精密稱定已知含量的中國(guó)滁州菊花博覽園滁菊藥材粉末6 份，每份約0.125 g，分別精密加入已知量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.3節(jié)下操作制備檢測(cè)樣品溶液，進(jìn)樣10 μL，計(jì)算平均加樣回收率(表4)。結(jié)果表明，平均回收率在94.57%～100.01%之間，RSD均小于3%，表明該方法回收率良好。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=6)

續(xù)表4 Table 4 continued

2.2 含量測(cè)定結(jié)果

取1.2.3節(jié)下7個(gè)不同栽培區(qū)域滁菊檢測(cè)樣品溶液，每個(gè)樣品平行制備2份，按1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，進(jìn)樣10 μL，得不同栽培區(qū)域滁菊中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素HPLC色譜圖(圖2)，以不同栽培區(qū)域不同成分峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即得。含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同栽培區(qū)域滁菊含量測(cè)定結(jié)果

圖2不同栽培區(qū)域滁菊HPLC色譜圖

Fig.2 HPLC chromatogram of ChuChrysanthemumin different cultivated areas

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，多位學(xué)者報(bào)道了同時(shí)測(cè)定滁菊及其他藥用菊花多種化學(xué)成分的方法。王月茹等建立了HPLC法測(cè)定菊花藥材中10 種主要化學(xué)成分的含量，作為中藥菊花的質(zhì)量控制的有效方法,為明確不同品種菊花的基原關(guān)系和品種鑒定研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[12]；屠萬(wàn)倩等建立HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地菊花中新綠原酸、綠原酸、異綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素等8 種成分的含量[13]，豐富了菊花的含量測(cè)定方法, 更科學(xué)、更全面的評(píng)價(jià)菊花的內(nèi)在質(zhì)量；黃艷梅等在“HPLC結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)不同產(chǎn)地菊花中化學(xué)成分的比較分析”中對(duì)滁菊進(jìn)行了多達(dá)14 種成分(綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、1,3-O-二咖啡?？鼘幩?、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、槲皮苷、芹菜素、黃芩苷、蘆丁、咖啡酸、蒙花苷、香葉木素)分析[14]，建立一種分析藥用菊花中14個(gè)成分的HPLC方法,并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)不同產(chǎn)地菊花的化學(xué)成分進(jìn)行比較分析。滁菊為著名道地藥材，已成為菊花品種中不可或缺的一部分，目前，HPLC法已常用于菊花的質(zhì)量控制研究，但HPLC法同時(shí)測(cè)定不同栽培區(qū)域滁菊中多種成分含量尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，研究不同栽培區(qū)域滁菊中多種成分含量很有必要。本試驗(yàn)采用HPLC法，建立了同時(shí)測(cè)定滁菊中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8種成分含量的方法。

本試驗(yàn)最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液，以及最佳洗脫梯度(見(jiàn)表1)；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。通過(guò)對(duì)該方法進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率考察，表明該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、精密度高、重現(xiàn)性好、平均回收率高。該方法可用于同時(shí)測(cè)定滁菊中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8種成分含量，對(duì)滁菊質(zhì)量控制具有重要意義。

通過(guò)對(duì)不同栽培區(qū)域滁菊的含量測(cè)定，各生長(zhǎng)區(qū)域綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A均明顯高于藥典標(biāo)準(zhǔn)。但不同生長(zhǎng)區(qū)域之間成分含量存在明顯差異，其中綠原酸含量最高的為中國(guó)滁州菊花博覽園；木犀草苷含量最高的是周崗鄉(xiāng)，其次為中國(guó)滁州菊花博覽園；異綠原酸A、異綠原酸C含量最高的均為中國(guó)滁州菊花博覽園；黃芩苷含量最高的為周崗鄉(xiāng)，其次為中國(guó)滁州菊花博覽園；槲皮素在各生長(zhǎng)區(qū)域含量均較少，含量相差不大；木犀草素、芹菜素均以城郊鄉(xiāng)含量最高，且與其他栽培區(qū)域相差較大。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明不同栽培區(qū)域的滁菊化學(xué)成分含量差異較大，造成含量差異的原因，以及成分與功效的相關(guān)性等相關(guān)問(wèn)題有待進(jìn)一步深入研究。