周禮華， 陳韓磊， 劉函冰， 韋 鈺， 錢偉偉

(蚌埠醫(yī)學(xué)院,安徽 蚌埠 233000)

擬除蟲菊酯(Py)是一類人工合成的新型農(nóng)藥，由于其具有高效、廣譜、低毒、低殘留等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用，如用于防治農(nóng)業(yè)害蟲、防治家庭及公共場所中的衛(wèi)生害蟲等。目前，擬除蟲菊酯類殺蟲劑的應(yīng)用已超過全世界殺蟲劑的30%[1]。研究顯示擬除蟲菊酯暴露可削弱機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)元退變，而神經(jīng)退行性病變和導(dǎo)致老年癡呆的帕金森病緊密聯(lián)系[2-4]。神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)元間、神經(jīng)元與靶細(xì)胞間發(fā)揮信號(hào)傳遞功能的化學(xué)物質(zhì)，作為信息傳遞體在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)等，單胺類神經(jīng)元軸突投影可影響到每一個(gè)腦區(qū)，對整個(gè)大腦功能都有影響[5]。本試驗(yàn)選用Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑氯氰菊酯(CYP)作為代表，研究CYP對C57BL/6老年鼠腦皮層及血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討擬除蟲菊酯類殺蟲劑對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性機(jī)制，為規(guī)范殺蟲劑使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雌小鼠、雄小鼠各10只，鼠齡超過180天，購于南京市青龍山動(dòng)物繁殖場，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001。供試動(dòng)物在蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行無菌飼養(yǎng)。系統(tǒng)內(nèi)溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，試驗(yàn)期間自由攝入食物和飲水。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 CYP標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司，批號(hào)：SLBH1254V)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0010)；5-HT ELISA Kit(批號(hào)：E-EL-0033c)、DA ELISA Kit(批號(hào)：E-EL-0046c)、NE ELISA Kit(批號(hào)：E-EL-0047c)，均購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.2.2 儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force，Neofuge 15R)，全自動(dòng)研磨儀(賽維爾，KH-III)，酶標(biāo)檢測儀(BioTeK，Epoch)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理 染毒前老年雄小鼠體質(zhì)量27.87±1.06 g，老年雌小鼠體質(zhì)量26.72±2.24 g，試驗(yàn)前各染毒組與對照組小鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組法，分別將雌、雄小鼠隨機(jī)分成兩組，其中，雄小鼠分為對照組及染毒組，雌小鼠分為對照組及染毒組，每組5只。CYP標(biāo)準(zhǔn)品用玉米油進(jìn)行溶解，染毒組給予CYP 100 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)4日。對照組以生理鹽水代替。每日注射前稱量小鼠體重，同時(shí)，觀察供試小鼠的日常活動(dòng)、精神情緒、攝食及飲水量的變化。

1.3.2 小鼠血清制備及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定 腹腔注射結(jié)束后4 h，水合氯醛麻醉小鼠，隨后進(jìn)行摘取眼球取血，每只小鼠收集血液0.5 mL，置于EP管內(nèi)，室溫靜置2 h，2 000×g離心15 min，分離血清，分裝后保存于-80 ℃冰箱待用。按照試劑盒說明書的步驟測定血清中5-HT、DA、NE的含量。

1.3.3 小鼠腦組織的制備及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的測定 在冰盤上摘取小鼠眼球血后，立即斷頭處死，依次剪開皮膚及顱骨，完整取出腦組織，分離大腦皮層。用生理鹽水沖洗腦組織表面殘留血液，濾紙吸干、稱重、剪碎，按照重量1∶9加入預(yù)冷生理鹽水，制成10%的組織勻漿。將勻漿液5 000×g離心10 min，取上清。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟測定腦組織中5-HT、DA、NE的含量。BCA法測定生物樣品中總蛋白濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般情況觀察

試驗(yàn)期間，對照組小鼠一般狀況較好，神態(tài)無異常。染毒組小鼠精神萎靡，體毛蓬亂，眼角周圍有不同程度的分泌物殘留，身體有撕咬痕跡。試驗(yàn)期間各組動(dòng)物無死亡現(xiàn)象。

2.2 小鼠體質(zhì)量觀察

如表1所示，染毒結(jié)束后老年雄小鼠體質(zhì)量為28.45±1.67 g，老年雌小鼠體質(zhì)量27.33±2.77 g，染毒前后雄小鼠、雌小鼠內(nèi)部分組之間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 氯氰菊酯腹腔注射前后老年小鼠體質(zhì)量變化

2.3 CYP對老年小鼠腦皮層5-HT、DA、NE的影響

試驗(yàn)結(jié)束，老年雄小鼠腦皮層5-HT、DA及NE的含量均低于對照組，其中5-HT和DA的含量與對照組差別顯著(P<0.05)；同樣，老年雌小鼠腦皮層5-HT、DA的含量高于對照組，與對照組差顯著(P<0.05)(表2)。

表2 老年小鼠腦皮層5-HT、DA、NE含量比較

注：與對照組相比， a表示P< 0.05;A表示P< 0.01

2.4 CYP對老年小鼠血清5-HT、DA、NE的含量

試驗(yàn)結(jié)束，老年雄小鼠血清5-HT、DA的含量低于對照組，與對照組差別顯著(P<0.05)，血清中NE的含量高于對照組，與對照組差別顯著(P<0.05)；老年雌小鼠血清5-HT、DA及NE含量高于對照組，與對照組差別顯著(P<0.05)(表3)。

表3 老年鼠血清5-HT、DA、NE含量比較

3 結(jié)論與討論

氯氰菊酯急性染毒對C57BL/6老年雄小鼠及老年雌小鼠腦皮層及血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE產(chǎn)生影響，氯氰菊酯通過干擾C57BL/6小鼠機(jī)體神經(jīng)遞質(zhì)含量而影響其神經(jīng)系統(tǒng)的功能。

神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)元間、神經(jīng)元與靶細(xì)胞間相互聯(lián)系的橋梁，機(jī)體的某些生理功能是多種神經(jīng)遞質(zhì)協(xié)同調(diào)控的結(jié)果。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)通過作用于神經(jīng)元或效應(yīng)細(xì)胞膜上的特定受體，完成各種信息的傳遞。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素等，這些神經(jīng)遞質(zhì)在組織中的含量反映著神經(jīng)遞質(zhì)生物合成、釋放、攝取、失活等過程[6]。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的異常影響著神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，進(jìn)而干擾機(jī)體運(yùn)動(dòng)、睡眠和情感等活動(dòng)。大腦多巴胺與肌肉協(xié)調(diào)能力密切相關(guān)，多巴胺含量下降時(shí)，運(yùn)動(dòng)能力下降[7]。Karen等發(fā)現(xiàn), 高濃度擬除蟲菊酯能夠減少C57BL/6小鼠紋狀體突觸小體對多巴胺的攝取，影響小鼠的運(yùn)動(dòng)及攝食量[8]。多巴胺合成的速度主要取決于酪氨酸經(jīng)化酶(Tyrosine transgenase，TH)，高劑量的擬除蟲菊酯可能通過抑制TH 酶的活力，使其催化合成多巴胺含量減少[9]。5-羥色胺又名血清素，是一種神經(jīng)遞質(zhì)和內(nèi)源性活性物質(zhì), 廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織中，具有營養(yǎng)因子的作用。5-HT需要通過相應(yīng)受體的介導(dǎo)才能產(chǎn)生作用。腦中化學(xué)物質(zhì)的殘留會(huì)干擾5-HT的攝取和合成，氯氰菊酯代謝產(chǎn)物在腦組織殘留會(huì)造成5-HT含量下降，進(jìn)而降低神經(jīng)遞質(zhì)水平，且降低程度與除蟲菊酯的使用量及使用頻率有關(guān)系[10]。擬除蟲菊酯使鈉離子通道關(guān)閉延遲，神經(jīng)元去極化，進(jìn)而干擾5-HT在紋狀體內(nèi)的正常傳遞，導(dǎo)致神經(jīng)元過度興奮[11]。

本試驗(yàn)以CYP (100 mg/kg)對C57BL/6老年小鼠進(jìn)行急性染毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示，老年雄小鼠腦皮層及血清中5-HT、DA的含量明顯低于對照組，與對照組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Tripathi等的研究一致。而老年雌小鼠腦皮層及血清中5-HT、DA、NE的含量卻高于對照組[12]。Aldridge等用有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱暴露出生后的小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)5-HT含量會(huì)因雌、雄差異而含量不同，即5-HT的含量差異具有性別選擇性[13]。Dam等在毒死蜱暴露幼年鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)，雄鼠和雌鼠在協(xié)調(diào)性和運(yùn)動(dòng)能力方面受到的影響不同[14]。本研究發(fā)現(xiàn)CYP腹腔注射對C57BL/6老年雄鼠及雌鼠腦皮層及血清中5-HT、DA、NE的含量均產(chǎn)生影響，染毒組與對照組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是雌小鼠和雄小鼠的結(jié)果不一致。目前擬對除蟲菊酯的研究主要集中在雄鼠，氯氰菊酯的毒性也可能具有性別差異性。同時(shí)，染毒劑量、染毒途徑、染毒時(shí)間乃至試驗(yàn)動(dòng)物的樣本量也可能都是影響結(jié)果的因素，氯氰菊酯對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE的影響還需更加深入地研究。

綜上所述，氯氰菊酯具有神經(jīng)毒性，擬除蟲菊酯類殺蟲劑不可濫用。