陳舒妤，石婧婧，鄒立思，劉訓(xùn)紅*，唐仁茂，馬繼梅，嚴(yán) 穎，趙 慧

1南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023；2江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，泰州 225500

五味子為大宗常用中藥材，系木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)，具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心的功效，用于久嗽虛喘，自汗盜汗，內(nèi)熱消渴，心悸失眠等癥[1]。現(xiàn)代研究表明，五味子主要含有木脂素、有機(jī)酸、揮發(fā)油等化學(xué)成分，具有降酶保肝、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等作用[2-4]。中藥療效的發(fā)揮是多種成分綜合作用的結(jié)果，針對(duì)五味子多元活性成分的特點(diǎn)，建立多元活性成分同時(shí)測(cè)定的方法，對(duì)探討多指標(biāo)成分的綜合評(píng)價(jià)體系具有實(shí)用性和有效性。

藥材的貯藏是中藥材品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)，有效的貯藏技術(shù)可以減少貯藏過(guò)程中由于自身特點(diǎn)及貯藏環(huán)境因素對(duì)中藥材質(zhì)量產(chǎn)生的不良影響，確保臨床用藥的療效。一般研究認(rèn)為藥材貯藏造成質(zhì)量下降的關(guān)鍵因素是藥材含水量、貯藏濕度、溫度和時(shí)間，尚少見(jiàn)對(duì)包裝材料的研究。目前，關(guān)于五味子藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)及儲(chǔ)藏研究，主要集中于木脂素和有機(jī)酸類成分的分析，多以某一類成分中的一種或多種化合物為評(píng)價(jià)指標(biāo)，尚少見(jiàn)對(duì)上述多元指標(biāo)成分同時(shí)測(cè)定的研究報(bào)道。其分析方法有高效液相色譜法(HPLC)[5]、超高效液相色譜法(UPLC)[6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)[7]等。HPLC難以解決組分共流出現(xiàn)象[8]，LC-MS 技術(shù)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，更適于中藥復(fù)雜體系的分離分析。其中，在四級(jí)桿-線性離子阱(QTRAP)系統(tǒng)下，MS/MS譜的靈敏度較標(biāo)準(zhǔn)三重四級(jí)桿高出數(shù)十倍至數(shù)百倍，則可以得到更豐富的MS/MS 數(shù)據(jù)[9]。本實(shí)驗(yàn)基于超快速液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿/線性離子阱質(zhì)譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)技術(shù)，同時(shí)測(cè)定五味子中木脂素及有機(jī)酸共15種指標(biāo)成分的含量，并結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析[10]和TOPSIS法對(duì)不同貯藏條件(不同包裝材料，不同貯藏溫度)五味子藥材進(jìn)行比較分析與綜合評(píng)價(jià)，旨在為五味子適宜儲(chǔ)藏條件的優(yōu)選提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)為五味子藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和全面控制提供新的方法參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SIL-20A XR超快速液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；AB QTRAP 4500 型三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)；Q-500B高速多功能粉碎機(jī)(上海冰都電器有限公司)；ME36S型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司，1/100萬(wàn))；KQ-500B超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 kHz)；湘儀H1650-W高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試藥與試劑

五味子甲素(批號(hào)：110764-200408)、五味子乙素(批號(hào)：110765-200407)、五味子醇甲(批號(hào)：110857-200709)、五味子酯甲(批號(hào)：111529-200503)、L-蘋果酸(批號(hào)：190014-201302)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；五味子丙素(批號(hào)：lw16051601)、五味子醇乙(批號(hào)：lw16071904)、五味子酯乙(批號(hào)：lw16100801)、戈米辛：D(批號(hào)：lw16032405)、戈米辛：J(批號(hào)：lw16092404)、當(dāng)歸?；昝仔粒篐(批號(hào)：lw16072204)、五味子酚(批號(hào)：lw16012701)、奎寧酸(批號(hào)：lw16071201)、酒石酸(批號(hào)：lw15122605)購(gòu)自南京良緯生物科技有限公司，純度均大于98%；原兒茶酸(批號(hào)：YECS20140411)購(gòu)自南京春秋生物工程有限公司，純度大于98%；乙腈、甲酸為色譜純，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；甲醇(批號(hào)：143135)為色譜純，江蘇漢邦科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.3 材料

五味子藥材由蘇中藥業(yè)集合股份有限公司提供，產(chǎn)地：吉林，批號(hào)：17032802，規(guī)格統(tǒng)貨，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)，留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。樣品由作者自己按不同貯藏條件(不同包裝材料，不同貯藏溫度)每份500 g貯藏半年后取出，樣品信息見(jiàn)表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取奎寧酸、酒石酸、L-蘋果酸、原兒茶酸、五味子醇甲、戈米辛 D 、戈米辛 J、五味子醇乙、當(dāng)歸?；昝仔?H 、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素 、五味子乙素 、五味子丙素、五味子酯甲的對(duì)照品適量，置5 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解制成質(zhì)量濃度分別為950.00、998.00、1 570.00、1 110.00、970.00、920.00、846.00、972.00、982.00、960.00、996.00、960.00、978.00、978.00、1 024.00 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，供分析用。取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇定容至10 mL制成混合對(duì)照品溶液，并逐級(jí)稀釋，得到一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，供分析用。

表1 不同貯藏條件樣品信息

注：S1～S8：貯藏于陰涼庫(kù)中考察不同包裝材料樣品；S1，S9～S12：以麻袋為包裝材料考察不同貯藏溫度樣品。

Note:S1-S8：All stored in cool warehouse to research different package materials;S1,S9-S12：All stored in sacks to research different temperature.

2.2 供試品溶液制備

精密稱定樣品粉末0.5 g，精密量取加入甲醇20 mL，密閉，稱重，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)40 min，放置冷卻，再次稱重，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量損失，過(guò)濾，濾液(12 000 rpm)離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液用甲醇稀釋25倍即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：SynergiTMHydro-RP 100? 柱(100 mm × 2.0 mm,2.5 μm)；流動(dòng)相：A為 0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～4 min、30%～52% B，4～8 min、52%～75% B，8～11 min、75%～90% B，11～15 min、90%～30% B，15～17.10 min、30%～30% B；柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧離子源(ESI)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描模式(MRM)檢測(cè)；氣簾氣流速35 L/min；霧化氣流速55 L/min；輔助氣流速55 L/min；離子源溫度550 ℃；噴霧電壓：正離子模式下5 500 V，負(fù)離子模式下-4 500 V。15種成分的質(zhì)譜具體參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 15種成分的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.5 分析方法

采用SynergiTMHydro-RP 100?色譜柱對(duì)色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化，按照優(yōu)化的條件進(jìn)行UFLC-QTRAP-MS/MS分析，并做方法學(xué)考察，用外標(biāo)法計(jì)算各樣品中15種功效成分的含量。根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果，用灰色關(guān)聯(lián)度及TOPSIS分析對(duì)不同貯藏條件五味子藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 提取條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分別考察了提取溶劑(50%、70%、100%甲醇)、料液比(1:20、1:40、1:60)及提取時(shí)間(20、40、60 min)。結(jié)果表明，以100%甲醇作為提取溶劑，料液比1:40，超聲40 min時(shí)相對(duì)峰面積較大。

3.2 色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水)及梯度洗脫條件對(duì)樣品中各峰色譜峰形及分離度的影響。結(jié)果顯示，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時(shí)，峰形更好且有良好的分離效果。因此選擇0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相梯度洗脫。實(shí)驗(yàn)同時(shí)選用正、負(fù)離子模式測(cè)定15種目標(biāo)成分的含量，其中4種有機(jī)酸(L-蘋果酸、酒石酸、原兒茶酸、奎寧酸)在負(fù)離子模式下有較強(qiáng)的離子響應(yīng)和更好的峰形，其他成分在正離子模式下有較強(qiáng)的離子響應(yīng)和更好的峰形。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限

精密吸取“2.1”項(xiàng)下一系列濃度的混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3”項(xiàng)和“2.4”項(xiàng)條件進(jìn)樣分析，以對(duì)照品的峰面積(Y)對(duì)相應(yīng)的濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍；以各化合物的3倍信噪比(S/N)相對(duì)應(yīng)的濃度為檢測(cè)限(LOD)，以各化合物的10倍信噪比(S/N)相對(duì)應(yīng)的濃度為定量限(LOQ)。結(jié)果見(jiàn)表3，圖1。

表3 15種成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限

3.3.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照溶液，進(jìn)樣量為1 μL，連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣6次，記錄15種目標(biāo)成分峰面積并計(jì)算RSD；取S1樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，吸取1 μL進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算各目標(biāo)成分含量的RSD；取S1樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，記錄15種目標(biāo)成分峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。

3.3 .3加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取9份已知含量的S1樣品各0.25 g，置于錐形瓶中，平均分為三組，分別加入3個(gè)不同水平(80 %、100 %、120 %)的各對(duì)照品溶液適量后，震蕩均勻，按“2.2”項(xiàng)下方法制備加樣回收率供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

圖1 15種成分的MRM圖Fig.1 Extracted ion current chromatograms of fifteen components注：1.奎寧酸；2.酒石酸；3.L-蘋果酸；4.原兒茶酸； 5.五味子醇甲；6.戈米辛D；7.戈米辛J；8.五味子醇乙；9.當(dāng)歸酰基戈米辛H；10.五味子酯乙；11.五味子酚；12.五味子甲素 13.五味子乙素；14.五味子丙素；15.五味子酯甲Note:1.Quinic acid；2.D(-)-Tartaric acid；3.(S)-malic acid；4.Protocatechuic acid；5.Schisandrin；6.Gomisin D；7.Gomisin J；8.Schisandrol B；9.Angeloylgomisin H；10.Schizantherin B；11.Schisanhenol； 12.Deoxyschizandrin；13.γ-schisandrin；14.Schizandrin C；15.Schisantherin

表45種目標(biāo)成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性(%，n=6)

Table 4 Precisions,repeatabilities and stabilities of fifteen components(%，n=6)

化合物Compounds精密度RSDPrecision RSD重復(fù)性RSDRepeatability RSD穩(wěn)定性RSDStability RSD12.43.51.123.12.12.331.83.21.242.32.53.353.10.73.161.11.51.272.03.03.082.62.40.892.51.63.1101.01.32.3112.64.91.5120.91.61.3131.90.51.1142.23.82.5150.72.21.0

表5 15種目標(biāo)成分加樣回收率(%，n=3)

續(xù)表5 (Continued Tab.5)

化合物Compounds樣品含量Content in sample(μg)加入量Standard added(μg)測(cè)得值Measured加樣回收率Recovery平均回收率±RSDAverage recovery ± RSDGomisin D32.44432.2006496.9632.44438.6407096.33戈米辛 J111.06588.83019998.6398.31±0.66Gomisin J111.065110.82622098.59111.065133.66824297.70五味子醇乙631.419505.440113299.0599.01±0.43Schisandrol B631.419631.800125698.85631.419758.160138399.13當(dāng)歸?；昝仔?H272.034218.00449099.8499.59±0.5Angeloylgomisin H272.034272.01454299.24272.034327.00659899.68五味子酯乙217.628173.76039099.0299.11±0.55Schizantherin B217.628217.92043398.98217.628261.12047799.33五味子酚68.87954.78012398.1997.92±1.95Schisanhenol68.87968.72413798.6368.87982.66814996.92五味子甲素166.465133.44029797.8398.71±0.82Deoxyschizandrin166.465166.08033198.86166.465199.68036599.42五味子乙素756.206604.404135899.6399.69±0.18γ-schisandrin756.206755.994151099.75756.206907.584166199.69五味子丙素162.472130.07429198.5798.15±0.63Schizandrin C162.472162.34832197.64162.472194.62235498.24五味子酯甲743.694595.149133899.8999.92±0.05Schisantherin743.694743.936148799.89743.694892.723163699.97

3.4 樣品含量測(cè)定

取五味子供試品溶液，按照上述色譜-質(zhì)譜條件測(cè)定，根據(jù)相應(yīng)線性關(guān)系計(jì)算供試樣品中15種成分的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 五味子中15成分含量(μg / g,n = 3)

續(xù)表6(Continued Tab.6)

Serial No.108141312155116793241S5487.422936.48636.242836.60638.232017.586102.68284.6684.60406.511148.622407.116.539738.314314.82S6461.452906.51623.252776.67641.231957.656032.76254.69114.86483.421128.652786.6610.499208.955103.88S7473.432467.04566.322407.11539.3515.385783.06255.6978.61318.62961.852357.176.687341.194045.15S8456.452856.57575.312646.82597.2823.676292.45232.7278.01466.441078.712397.125.977980.424115.06S9798.882895.95653.092766.13656.0839.345951.67276.61117.84372.481158.383285.406.389896.156540.84S10738.972646.30572.202616.34590.1798.865712.00233.6764.01485.321028.562616.348.616620.733854.60S11500.302466.55545.242446.57541.2462.215592.17227.6899.26288.60995.612846.0211.084903.145522.27S12384.542307.23535.362297.24551.3439.755353.58227.7368.22269.68811.032616.868.954824.214874.15

3.5 灰色關(guān)聯(lián)度法和TOPSIS法

按照文獻(xiàn)[10,11]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各樣品的關(guān)聯(lián)度ri和相對(duì)接近度Ci及其排序(見(jiàn)表7)。

表7 評(píng)價(jià)對(duì)象的ri和Ci值及其排序

注：差異是指各評(píng)價(jià)對(duì)象與最優(yōu)評(píng)價(jià)對(duì)象的差距，差異=(關(guān)聯(lián)度或Ci最大值-各評(píng)價(jià)對(duì)象關(guān)聯(lián)度或Ci值)/最大值×100%。

Note:Differences of rior Ciwere the distance between each sample and the best sample,difference=(MAX rior MAX Ci- rior Ci)/MAX×100%.

3.6 灰色關(guān)聯(lián)度分析與TOPSIS分析比較

根據(jù)表7，對(duì)比2個(gè)排序，可知灰色關(guān)聯(lián)度分析和TOPSIS 分析結(jié)果基本一致，均以S4樣品綜合質(zhì)量最優(yōu)，其次是S3、S1樣品，分別為以聚乙烯密封袋、陶瓷缸、麻袋為包裝材料貯藏于陰涼庫(kù)的樣品。以麻袋為包裝材料考察不同貯藏溫度的樣品，貯藏于常溫及陰涼庫(kù)的樣品綜合質(zhì)量較好，其余樣品綜合質(zhì)量較差，尤其是貯藏于超低溫的樣品S12，可見(jiàn)不是貯藏溫度越低越好。ri與Ci的最大差異分別達(dá)到57.5 %與81.3 %，因此TOPSIS 分析能夠更好的區(qū)分樣品的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。

4 結(jié)論

中藥材的干燥儲(chǔ)藏是最常見(jiàn)的一種藥材保存方法，但不適宜的貯存條件會(huì)引起霉變、蟲(chóng)蛀及有效成分的含量變化，降低藥材的質(zhì)量[5,12]。有效的貯藏技術(shù)可以減少不良因素對(duì)藥材質(zhì)量的影響，確保臨床療效。針對(duì)目前五味子貯藏研究尚少、實(shí)際貯藏尚無(wú)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的情況，本實(shí)驗(yàn)以15種功效成分為考察指標(biāo)，探討不同貯藏溫度(常溫、陰涼庫(kù)、冷庫(kù)、冰柜、低溫柜)及不同包裝材料(麻袋、塑料編織袋、陶瓷缸、聚乙烯密封袋、玻璃缸、牛皮紙袋、鋁塑袋、布袋)對(duì)五味子藥材質(zhì)量的影響。含量測(cè)定結(jié)果表明，所分析的五味子樣品中，五味子醇甲含量均大于0.04%，符合《中國(guó)藥典》2015版一部的標(biāo)準(zhǔn)；木脂素類成分以五味子醇甲和五味子醇乙的含量較高，有機(jī)酸類成分以原兒茶酸和奎寧酸的含量較高。由于不同貯藏條件五味子樣品中木脂素類及有機(jī)酸類15種目標(biāo)成分的含量不一，難以直觀判斷，因而采用灰色關(guān)聯(lián)度分析及TOPSIS分析進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，分析結(jié)果顯示，S4的綜合質(zhì)量最好。聚乙烯密封袋具有較好的密封性,能有效防止潮濕空氣的滲入,在貯存過(guò)程中減少外界環(huán)境的影響，這與如今大多數(shù)中藥房五味子藥材的包裝材料一致。貯藏于陰涼庫(kù)的樣品S1、S3的綜合質(zhì)量也較好，顯示麻袋和陶瓷缸也是較好的包裝材料，麻袋具有良好的保溫性和吸潮性，而陶瓷缸的防潮性和隔熱性良好,一般情況下外界熱空氣和潮濕空氣不易滲透進(jìn)入。麻袋較陶瓷缸更為輕便，在實(shí)際大生產(chǎn)中可以考慮使用。貯藏于陰涼庫(kù)的樣品S1～S6綜合質(zhì)量較好，說(shuō)明陰涼庫(kù)是貯藏五味子較為適宜的溫度。

本實(shí)驗(yàn)采用超快速液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿/線性離子阱質(zhì)譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)同時(shí)測(cè)定五味子中木脂素類及有機(jī)酸類共15種指標(biāo)成分的含量，并結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析和TOPSIS法對(duì)不同貯藏條件五味子藥材進(jìn)行比較分析與綜合評(píng)價(jià)。所建立的方法準(zhǔn)確、可靠，可用于五味子藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)，本研究可為五味子適宜儲(chǔ)藏條件的優(yōu)選提供基礎(chǔ)資料。