顏 莎，馬瑞婧，楊 柳，李金玉，楊曉蓓，胡江苗*

1云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程藥學(xué)院，昆明650091；2中國科學(xué)院昆明植物研究所植物醫(yī)生研發(fā)中心，昆明650201

美花石斛(DendrobiumloddigesiiRolfe)是蘭科石斛屬多年生草本植物，產(chǎn)于廣西(那坡、融水、凌云、九州、永福、隆林等地)、廣東南部(羅浮山)、海南(白沙)、貴州西南部(羅甸、興義、關(guān)嶺)、云南南部(思茅)，在老撾、越南也有分布[1]；其莖纖細(xì)而下垂，自然生成或盆栽時(shí)莖常呈半圓形彎曲匍狀，美花石斛收載于2015“化妝品名錄”，也曾收載于《中華人民共和國藥典》(2000年版)。目前對于美花石斛的物質(zhì)基礎(chǔ)研究并不多，迄今為止從美花石斛中得到的化合物類型有茋類[2]、木脂素[2]、甾體[2]、酚類[3]、生物堿[4]等；一部分研究集中在美花石斛的栽培[5]以及美花石斛多糖[6]，另一部分研究表明它的酚性成分具有抗糖尿病活性，可用于治療2型糖尿病[7]。

研究表明0.01%的膠原蛋白純?nèi)芤壕湍苄纬珊芎玫谋Ｋ畬樱┙o皮膚所需要的全部水分[8]；而DPPH自由基活潑,具有強(qiáng)氧化性,正常情況下在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要的免疫作用,并能被機(jī)體存在的抗氧化系統(tǒng)所清除，隨著外界環(huán)境的惡化,人體內(nèi)自由基產(chǎn)生越來越多,其副作用也愈加明顯,它可使脂褐素生成增加,線粒體DNA突變、蛋白質(zhì)合成減少等作用加速衰老[9]；酪氨酸酶具有單酚加羥酶和二酚氧化酶的活性，是目前已知的生物體中唯一參與黑色素合成的關(guān)鍵酶，因此酪氨酸激酶抑制劑可以美白祛斑?；谡n題組前期對石斛的研究基礎(chǔ)和經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)也為了更好的開發(fā)出美花石斛的護(hù)膚活性，本文利用各種色譜法從美花石斛中分離得到了12個化合物并且從DPPH自由基清除率、膠原蛋白分泌、酪氨酸酶抑制率三個方面進(jìn)行了護(hù)膚活性的評價(jià)，最終發(fā)現(xiàn)了3個化合物具有護(hù)膚活性。

1 材料與儀器

Buker Avance Ⅲ-400超導(dǎo)核磁共振儀(Buker Biospin GmbH,Rheinstetten,Germany)、Buker Avance Ⅲ-500超導(dǎo)核磁共振儀(Buker Biospin GmbH,Rheinstetten,Germany)、Buker Avance Ⅲ-600型超導(dǎo)核磁共振儀(Buker Biospin GmbH,Rheinstetten,Germany),API QSTAR Pulsari 液相四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MDS Scipaszex,Concord,Ontario,Canada),Auto Spec Premier P776 三扇型雙聚焦質(zhì)譜儀(Waters,USA),薄層層析硅膠、柱層析硅膠(200～300目，300～400目,青島美高集團(tuán)有限公司，中國)，Sephadex LH-20 (20～150 um,Ameisham Biosciences,Uppsala,Sweden),MCI gel CHP-20P (75～150 μm，Mitsubishi Chemical Corp.,Tokyo,Japan),Lichroprep RP-18 gel (40～63 μm,Merk,Darmstadt,Germany),美花石斛采自云南文山，經(jīng)云南大學(xué)虞泓教授鑒定為美花石斛(Dendrobiumloddigesii)。

成人真皮纖維原細(xì)胞(human dermal fibroblasts-adult,HDFa)購自Cascade Biologics,DMEM(高糖)培養(yǎng)基、PBS、Hank平衡鹽溶液(hank’s balanced salt solution,HBSS)、青鏈霉素和胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司；0.25%胰酶(含EDTA)購自Gibico公司；DPPH、水溶性維生素E(Trolox)、蘑菇酪氨酸酶、左旋多巴(L-Dopa)和曲酸(Kojic Acid)購自Sigma公司；轉(zhuǎn)移生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)購自Peprotech公司；膠原蛋白ELISA試劑盒購自TaKaRa公司；MTS試劑購自Promega公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 美花石斛活性成分的提取分離

干燥的美花石斛的全草(10.2 kg)粉碎后用80%的EtOH 室溫浸泡三次，減壓濃縮得浸膏溶于水，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別得到乙酸乙酯部分220 g和正丁醇部分270 g。將乙酸乙酯部分溶解，吸附于450 g硅膠(200～300目)，經(jīng)硅膠柱層析石油醚-丙酮梯度洗脫(15∶1,13∶1,10∶1,5∶1,3;1,0∶1),經(jīng)TLC 檢測合并為22個組分(Fr.1-22)。Fr.11(6 g)經(jīng)過正向硅膠柱(氯仿-甲醇 300∶1)洗脫：Fr.11.1 經(jīng)過MCI 色譜(60%～95% 甲醇-水洗脫)和正向硅膠(氯仿-甲醇 300∶1洗脫)分離得到化合物8(69 mg)。Fr.13(850 mg)經(jīng)過MCI 色譜(60%～95% 甲醇-水洗脫)分離：Fr.13.1 經(jīng)過HPLC (35% 甲醇-水洗脫)分離得到化合物9(6 mg)。Fr.15(5.4 g)經(jīng)過MCI 色譜(60%～95% 甲醇-水洗脫)分離得到化合物1(56 mg)。Fr.16(19 g)經(jīng)過正相硅膠色譜(氯仿-甲醇 100∶1～20∶1)分離：Fr.16.4.1～Fr.16.4.5.這5個餾分分別經(jīng)過 Sephadex LH-20 色譜(90% 甲醇-水)分離得到10(2 mg),11(3 mg),12(1 mg)；Fr.19 (20 g)經(jīng)過MCI 色譜(30%-100% 甲醇-水)分離：Fr.19.4 經(jīng)過Sephadex LH-20 (90% 甲醇-水)分離得到2(15 mg)；Fr.19.6經(jīng)過正向硅膠色譜(氯仿-甲醇 30∶1)分離：Fr.19.6.1經(jīng)過正向硅膠色譜(氯仿-甲醇 30∶1)分離,Fr.19.7經(jīng)過正向硅膠柱色譜(氯仿-甲醇 60∶1)和Sephadex LH-20 色譜(90% 甲醇-水)分離得到6(4 mg)。Fr.20(12 g)經(jīng)過MCI 色譜(30%～100% 甲醇-水)分離,Fr.20.2經(jīng)過正向硅膠柱色譜(氯仿-甲醇 30∶1)和Sephadex LH-20 色譜(90% 甲醇-水)分離得到4(2 mg)。Fr.20.3經(jīng)過正向硅膠柱色譜(氯仿-甲醇 80∶1)分離,Fr.20.3.2經(jīng)過正向硅膠柱色譜(氯仿-甲醇 80∶1)分離得到7(54 mg),Fr.20.3.3經(jīng)過正向硅膠柱色譜(氯仿-甲醇 20∶1)、Sephadex LH-20 色譜(90% 甲醇-水)分離得到5(23 mg)；Fr.21(7 g)經(jīng)過MCI 柱色譜(30%～100% 甲醇-水)分離：Fr.21.2經(jīng)過正向硅膠柱(氯仿-甲醇 10∶1)洗脫,Fr.21.2.2 黃色沉淀，用甲醇洗脫得到化合物3(10 mg)。

2.2 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

將待測藥物(100 μg/mL)與DPPH(終濃度為100 μmol/L)混合反應(yīng)，設(shè)定3個重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不含藥物的空白對照孔和Trolox陽性對照孔，30 °C，1 h，酶標(biāo)儀測定OD值，檢測波長為515 nm，計(jì)算得到抗氧化率。

抗氧化率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD515 nm/ 空白孔OD515 nm)× 100

2.3 酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)

將待測藥物(100 μg/mL)與L-Dopa混合，L-Dopa的終濃度為1.25 mM。加入酪氨酸酶(終濃度25 U/mL)開始反應(yīng)，設(shè)定3個重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不含藥物的空白對照和Kojic Acid陽性對照，室溫放置，5 min，酶標(biāo)儀測定OD值，檢測波長為490 nm。計(jì)算得到酪氨酸酶活性抑制率。

酪氨酸酶活性抑制率(%)=(1-樣品OD490 nm/ 實(shí)驗(yàn)對照孔OD490 nm)× 100

2.4 HDFa膠原蛋白分泌實(shí)驗(yàn)

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將HDFa細(xì)胞與待測化合物(終濃度：10 μg/mL)混合，設(shè)置不含藥物的空白對照和TGF-β陽性對照；37 °C，5% CO2培養(yǎng)3天，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，存于-80 °C；加入MTS，采用MTS比色法檢測490 nm的OD值；按膠原蛋白ELISA試劑盒中提供的方法檢測膠原蛋白的分泌，酶標(biāo)儀測定OD值，檢測波長為450 nm。計(jì)算得到膠原蛋白分泌增加率。

膠原蛋白分泌增加率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD450 nm/ 細(xì)胞存活率 / 空白孔OD450 nm- 1)× 100

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末(甲醇)；C15H12O3;MW=240.25;1H NMR (MeOD,600 MHz)δ:6.97(1H,d,J=2.4 Hz,H-1),6.89 (1H,d,J=2.4 Hz,H-3),7.10 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6),7.39 (1H,t,J=7.5 Hz,H-7),7.35 (1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,H-8),7.55 (1H,d,J=8.4 Hz,H-9),7.42 (1H,d,J=9.0,H-10),4.04 (3H,s,H-OMe);13C NMR (MeOD,150 MHz)δ:108.3 (d,C-1),157.9 (s,C-2),103.2 (d,C-3),155.0 (s,C-4),156.9 (s,C-5),117.2 (d,C-6),130.0 (d,C-7),121.8 (d,C-8),127.7 (d,C-9),127.4 (d,C-10),114.4 (s,C-4a),120.2 (s,C-4b),135.5 (s,C-8a),137.8 (s,C-10a),59.0 (q,-OMe)[10]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對照基本一致，故確定為拖鞋狀石斛素。

化合物2黃色粉末(甲醇)；C14H12O3;MW=228.08;1H NMR (MeOD,400 MHz)δ:6.25 (1H,d,J=2.4Hz,H-1),6.20 (1H,d,J=2.4Hz,H-3),8.13 (1H,d,J=9.3Hz,H-4),6.61 (1H,dd,J=9.3,2.6 Hz,H-6),6.63 (1H,d,J=2.6 Hz,H-8),2.26 (4H,m,H-9,10);13C NMR (MeOD,100 MHz)δ:107.6(d,C-1),156.4 (s,C-2),102.7 (d,C-3),157.0 (d,C-4),129.0 (s,C-5),113.6 (d,C-6),155.8 (s,C-7),115.0 (d,C-8),31.3 (t,C-9),31.8 (t,C-10),115.3 (s,C-4a),126.7 (s,C-4b),142.0 (s,C-8a),140.2 (s,C-10a)[10]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對照基本一致，故確定為2,4,7-三羥基-9,10-二氫菲。

化合物3黃色粉末(甲醇)；C14H12O4;MW=244.07;1H NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:2.80 (1H,dd,J=15.6,3.0 Hz,H-2a),2.56 (1H,dd,J=16.2,9.0 Hz,H-2b),4.17 (1H,m,H-3),3.16 (1H,m,H-4a),2.91 (1H,dd,J=16.2,7.8 Hz,H-4b),7.41 (1H,d,J=3.0 Hz,H-5),7.12 (1H,dd,J=9.3,3.0 Hz,H-7),9.28 (1H,d,J=9.0 Hz,H-8),10.92 (1H,brs,H-10);13C NMR (DMSO-d6,150 MHz)δ:197.1 (s,C-1),49.5 (t,C-2),65.1 (d,C-3),40.2 (t,C-4),104.3 (d,C-5),154.3 (s,C-6),120.6 (d,C-7),127.7 (d,C-8),157.2 (s,C-9),109.2 (d,C-10),143.7 (s,C-4a),126.9 (s,C-8a),118.9 (s,C-9a),125.7 (s,C-10a)[11]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對照基本一致，故確定為3,6,9-三羥基-3,4-二氫蒽-1(2H)-酮。

化合物4黃色固體(甲醇)；C20H20O6;MW=360.16;1H NMR (MeOD,600 MHz)δ:6.80 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.72 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.65 (1H,dd,J=8.4,1.8 Hz,H-6),2.94 (1H,dd,J=13.2,4.8 Hz,H-7a),2.50 (1H,dd,J=13.2,11.4 Hz,H-7b),2.74 (1H,m,H-8),3.99 (1H,dd,J=8.4,6.6 Hz,H-9a),3.73 (1H,dd,J=8.4,6.6 Hz,H-9b),6.76 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),6.77 (1H,dd,J=1.8,1.2 Hz,H-4′),6.91 (1H,d,J=1.2 Hz,H-6′),4.75 (1H,d,J=6.6 Hz,H-7′),2.38 (1H,m,H-8′),3.84 (1H,overlap,H-9′a),3.63 (1H,dd,J=10.8,6.0 Hz,H-9′b),3.83 (3H,s,3-OMe),3.85 (3H,s,5′-OMe);13C NMR (MeOD,150 MHz)δ:133.7 (s,C-1),113.5 (d,C-2),146.0 (s,C-3),149.2 (s,C-4,5’),116.3 (d,C-5),122.3 (d,C-6),33.8 (t,C-7),44.0 (d,C-8),73.7 (t,C-9),135.9 (s,C-1′),120.0 (d,C-2′),147.2 (s,C-3′),116.1 (d,C-4′),110.7 (d,C-6′),84.2 (d,C-7′),54.3 (d,C-8′),60.6 (t,C-9′),56.5 (q,3,5′-OMe)[12]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對照基本一致，故確定為3,5′-二甲氧基-3′,4,9′-三羥基-7′,9-環(huán)氧-8,8′-木酚素。

化合物5白色固體(甲醇)；C25H26O7;MW=438.17;1H NMR (MeOD,500 MHz)δ:4.55 (1H,d,J=8.0 Hz,H-2),3.96 (1H,m,H-3),2.82 (1H,dd,J=15.5,5.5 Hz,H-4a),2.52 (1H,dd,J=15.5,8.5 Hz,H-4b),6.26 (1H,d,J=2.5Hz,H-6),6.17 (1H,d,J=2.5Hz,H-8),6.95 (1H,d,J=1.5Hz,H-2′),6.79 (1H,d,J=8.0 Hz,H-3′),6.83 (1H,d,J=1.5 Hz,H-6′′),6.61 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2′′),6.68 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′′),6.59 (1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6′′),2.73 (4H,m,H-α,α′),3.82 (3H,s,3′′-OMe);13C NMR (MeOD,125 MHz)δ:82.9 (d,C-2),69.1 (d,C-3),31.6 (t,C-4),143.3 (s,C-5),110.5 (d,C-6),157.4 (s,C-7),101.9 (d,C-8),156.5 (s,C-9),111.5 (s,C-10),132.0 (s,C-1′),111.9 (d,C-2′),148.6 (s,C-3′),147.5 (s,C-4′),116.0 (d,C-5′),121.4 (d,C-6′),134.6 (s,C-1′′),113.3 (d,C-2′′),148.9 (s,C-3′′),145.6 (s,C-4′′),116.1 (d,C-5′′),121.9 (d,C-6′′),36.1 (t,C-α),37.4 (t,C- α′),56.3 (q,3′-OMe),56.4 (q,3′′-OMe)[13]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對照基本一致，故確定為5-(4-羥基-3-甲氧基苯乙基)-2-(4-羥基-3-甲氧基苯基)苯并二氫呋喃-3,7-二醇。

化合物6白色固體(甲醇)；C26H28O7;MW=452.18;1H NMR (MeOD,600 MHz)δ:4.59 (1H,d,J=7.8 Hz,H-2),3.99 (1H,m,H-3),2.87 (1H,dd,J=15.6,5.4 Hz,H-4a),2.57 (1H,dd,J=15.6,9.0 Hz,H-4b),6.35 (1H,d,J=2.4 Hz,H-6),6.29 (1H,d,J=2.4Hz,H-8),6.97 (1H,d,J=1.8Hz,H-2′),6.69 (1H,d,J=7.8 Hz,H-3′),6.85 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6′),6.63 (1H,d,J=1.2 Hz,H-2′′),6.80 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′′),6.60 (1H,dd,J=8.4,1.2 Hz,H-6′′),2.79 (4H,m,H-α,α′),3.85 (3H,s,7-OMe),3.78 (3H,s,3′′-OMe),3.70 (3H,s,3′-OMe);13C NMR (MeOD,150 MHz)δ:83.1 (d,C-2),69.2 (d,C-3),31.8 (t,C-4),143.5 (s,C-5),119.6 (d,C-6),160.4 (s,C-7),100.4 (d,C-8),156.7 (s,C-9),112.7 (s,C-10),132.1 (s,C-1′),111.9 (d,C-2′),148.0 (s,C-3′),147.7 (s,C-4′),116.1 (d,C-5′),121.5 (d,C-6′),134.6 (s,C-1′′),113.5 (d,C-2′′),149.0 (s,C-3′′),145.8 (s,C-4′′),116.2 (d,C-5′′),122.1 (d,C-6′′),36.4 (t,C-α),37.6 (t,C- α′),56.5 (q,7-OMe),56.4 (q,3′′-OMe),55.7 (q,3-OMe)[14]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]對照基本一致，故確定為5-(4′′-羥基-3′′-甲氧基苯乙基)-2-(4′-羥基-5′-甲氧基苯基)-7-甲氧基苯并二氫吡喃-3-醇。

化合物7黃色顆粒狀結(jié)晶(甲醇)；C22H26O8;MW=418.16;1H NMR (MeOD,500 MHz)δ:3.10 (2H,m,H-1,5),4.67 (2H,d,J=4.0,H-2,6),3.84 (2H,dd,J=9.0,3.5 Hz,H-4b,8b),4.22 (2H,dd,J=9.0,6.5 Hz,H-4a,8a),3.80 (12H,s,3,5.3′,5′-OMe),6.63 (4H,s,H-2′,6′,2′′,6′′);13C NMR (MeOD,125 MHz)δ:55.5 (d,C-1,5),87.6 (d,C-2,6),72.8 (t,C-4,8),133.2 (s,C-1′,1′′),104.5 (d,C-2′,6′,2′′,6′′),56.8 (q,3,5,3′,5′-OMe),136.1 (s,C-4′,4′′),149.3 (s,C-3′,5′,3′′,5′′)[15]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對照基本一致，故確定為丁香脂素。

化合物8黃色結(jié)晶(氯仿)；C8H8O3;MW=152.05;1H NMR (CDCl3,600 MHz)δ;6.87 (1H,br s,H-2),7.05 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5),7.43 (1H,d,J=7.8 Hz,H-6),9.81 (1H,s,CHO),3.93 (3H,s,OMe);13C NMR (CDCl3,150 MHz)δ:127.9 (s,C-1),114.7 (d,C-2),147.4 (s,C-3),152.1 (s,C-4),109.0 (d,C-5),127.7 (d,C-6),191.3 (d,CHO),56.1 (q,OMe)[16]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對照基本一致，故確定為異香草醛。

化合物9黃色粉末(氯仿)；C10H10O3;MW=178.06;1H NMR (CDCl3,600 MHz)δ:7.07 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.97 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5),7.13 (1H,dd,J=8.4,1.8 Hz,H-6),7.41 (1H,d,J=16.2 Hz,H-7),6.60 (1H,dd,J=15.6,7.8 Hz,H-8),9.66 (1H,d,J=7.2,H-9),3.95 (3H,s,-OMe);13C NMR (CDCl3,150 MHz)δ:126.9 (s,C-1),109.6 (d,C-2),147.1 (s,C-3),149.1 (s,C-4),115.1 (d,C-5),124.3 (d,C-6),153.4 (d,C-7),126.6 (d,C-8),193.9 (d,C-9),56.2 (q,-OMe)[17]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]對照基本一致，故確定為松柏醛。

化合物10黃色粉末(甲醇)；C8H10O3;MW=154.06;1H NMR (MeOD,600 MHz)δ:6.75 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5),6.78 (1H,dd,J=8.4,1.8Hz,H-6),6.94 (1H,d,J=1.8,H-2),4.50 (2H,s,H-7),3.86 (3H,s,4-OMe);13C NMR (MeOD,150 MHz)δ:134.3 (s,C-1),116.1 (d,C-2),147.1 (s,C-3),149.1 (s,C-4),112.2 (d,C-5),121.2 (d,C-6),56.4 (q,4-OMe),65.5 (t,C-7)[18]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]對照基本一致，故確定為2-甲氧基-5-羥甲基苯酚。

化合物11黃色油狀物(甲醇)；C10H14O3;MW=182.09;1H NMR (MeOD,600 MHz)δ:6.77 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.69 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5),6.62 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6),2.59 (2H,t,J=7.8 Hz,H-7),1.80 (2H,m,H-8),3.55 (2H,t,J=6.6 Hz,H-9),3.83 (3H,s,3-OMe);13C NMR (MeOD,150 MHz)δ:135.1 (s,C-1),113.2 (d,C-2),149.0 (s,C-3),145.6 (s,C-4),116.2 (d,C-5),122.0 (d,C-6),35.9 (t,C-7),32.8 (t,C-8),62.4 (t,C-9),56.4 (q,3-OMe)[19]。以上數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜與文獻(xiàn)[19]對照基本一致，故確定為二氫松柏醇。

化合物12黃色油狀物(甲醇)；C9H12O3;MW=168.08;1H NMR (MeOD,600 MHz)δ:6.80 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.71 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5),6.65 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6),2.73 (2H,t,J=7.2 Hz,H-7),3.71 (2H,t,J=7.2 Hz,H-8),3.83 (3H,s,3-OMe);13C NMR (MeOD,150 MHz)δ:131.9 (s,C-1),113.8 (d,C-2),149.0 (s,C-3),145,6 (s,C-4),116.2 (d,C-5),122.5 (d,C-6),40.0 (t,C-7),64.7 (t,C-8),56.4 (q,3-OMe)[20]。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]對照基本一致，故確定為4-羥基-3- 甲氧基苯乙醇。

3.2 美白活性測試結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對12個樣品的DPPH自由基清除能力、酪氨酸酶抑制能力及促膠原蛋白分泌能力進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示，100 (g/mL濃度下，化合物1、2、6的DPPH 自由基清除率分別為84.4%、94.6%、89.7%；12個合物均沒有酪氨酸酶抑制活性(表 1),HDFa共培養(yǎng)的結(jié)果顯示化合物2在10 ug/mL時(shí)，HDFa細(xì)胞膠原蛋白分泌量增加了25.6%。

表1 抗氧化、酪氨酸酶抑制率、膠原蛋白分泌

注：Trolox:25μg/mL;Kojic acid:10μg/mL;TGF-β:0.01μg/mL;a:DPPH 自由基清除陽性對照；b:酪氨酸激酶抑制劑；c:膠原蛋白陽性對照。

Note:aPositive control used for DPPH radical scavenging assay at the concentration of 25μg/mL.b Positive control used for anti-tyrosinase assay at the concentration of 10 μg/mL.c Positive control used for collagen production assay at the concentration of 0.01 μg/mL.

4 結(jié)論

從結(jié)果可知化合物1、2、6可以有效地清除DPPH自由基(>80%)，顯示良好的抗氧化活性；化合物2顯示可以很好的促進(jìn)膠原蛋白的分泌(>20%)，表明其具有抗衰老活性；但12個化合物均沒有顯示出抑制酪氨酸激酶的活性(>30%)。

目前關(guān)于美花石斛的化學(xué)基礎(chǔ)研究較少，對于美花石斛的美白活性的研究也較少，本文從美花石斛的全草中分離得到了12個化合物，化合物類型包括蒽醌類，木脂素類，黃烷-3-醇類以及簡單的苯環(huán)取代物。同時(shí)對12個化合物的DPPH自由基清除能力、酪氨酸酶抑制能力及促膠原蛋白分泌能力進(jìn)行評價(jià)。通過比較化合物1、2、6的化學(xué)結(jié)構(gòu)可知，美花石斛中的化合物清除DPPH 自由基的能力為蒽醌化合物強(qiáng)于黃烷-3-醇類化合物；通過比較化合物1、2的化學(xué)結(jié)構(gòu)可知，蒽醌類化合物中羥基的數(shù)量越多，其促進(jìn)自由基分泌的能力越強(qiáng)。本文在明確了美花石斛護(hù)膚作用的活性物質(zhì)的同時(shí)也提供美花石斛護(hù)膚活性的科學(xué)依據(jù)。