呂春華 ，王宇光 ，於麗華 ，楊瑞瑞 ，耿貴

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080）

0 引言

土壤鹽漬化是世界上干旱和半干旱地區(qū)最普遍的農(nóng)業(yè)及環(huán)境問(wèn)題之一。截至目前為止，全世界共有15億公頃耕地，約77 Mhm2（5%）的土地受到過(guò)量含鹽的影響[1]。在中國(guó)，鹽漬土的面積約為34Mhm2，占中國(guó)陸地面積的3.6%，相當(dāng)于總耕地面積的三分之一[2]。甜菜（Beta vulgaris L.）是藜科甜菜屬，二年生草本植物，廣泛種植于中國(guó)北部的干旱和半干旱地區(qū)，和甘蔗一起被認(rèn)為是我國(guó)兩大糖料作物。雖然甜菜是耐鹽性較強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)作物，但近年來(lái)隨著土壤鹽漬化的嚴(yán)重對(duì)甜菜產(chǎn)量和質(zhì)量的影響也越來(lái)越大[3-4]。雖然通過(guò)合理的水土管理以及地膜覆蓋等方法可以減輕鹽分對(duì)甜菜的危害，但因耗時(shí)、費(fèi)力、見(jiàn)效慢所以實(shí)現(xiàn)較困難[5]。因此，深入開(kāi)展甜菜耐鹽性的研究，選育耐鹽性甜菜品種，對(duì)于擴(kuò)大甜菜的種植面積、提高鹽堿地甜菜產(chǎn)質(zhì)量都具有十分重要的意義。

1 甜菜耐鹽相關(guān)基因

近年來(lái)，許多參與滲透調(diào)節(jié)、抗氧化保護(hù)酶以及其他功能等方面的耐鹽相關(guān)基因已經(jīng)從甜菜植株中獲得，而且這些基因?qū)τ谔鸩嗽谀望}相關(guān)功能方面的特性也得到肯定。

1.1 滲透調(diào)節(jié)有關(guān)基因

1.1.1 脯氨酸合成相關(guān)基因

在植物受到逆境脅迫時(shí)，脯氨酸是主要的滲透調(diào)節(jié)劑，其生物合成的前體是谷氨酸，在合成途徑中起主要作用的兩種關(guān)鍵酶△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和△1-吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）[6]。Miller等克隆了紫花苜蓿脯氨酸脫氫酶（MsPDH）基因和△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（MsP5CDH）基因，結(jié)果顯示鹽脅迫引起的脯氨酸積累和MsPDH基因的轉(zhuǎn)錄水平降低呈正相關(guān)[7]。但是關(guān)于甜菜在相關(guān)基因方面的報(bào)道尚少。脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物代謝過(guò)程中重要的調(diào)控因子，在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)起重要作用。Yamada報(bào)道鹽脅迫下甜菜葉柄中脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（BetT/ProT）不斷積累以應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境[8]。

1.1.2 甜菜堿合成相關(guān)基因

甘氨酸甜菜堿（N,N,N-trimethylglycine，簡(jiǎn)稱甜菜堿）是一種重要的滲透保護(hù)劑，是由膽堿單加氧酶（CMO）和甜菜堿醛脫氫酶（BADH）兩步氧化反應(yīng)非生物脅迫合成的[9]。呂笑言等利用PCR克隆獲得甜菜M14品系甜菜堿合成相關(guān)基因膽堿單加氧酶基因BvM14-CMO和甜菜堿醛脫氫酶基因BvM14-BADH的cDNA全長(zhǎng)，熒光定量PCR測(cè)試表明鹽脅迫下BvM14-CMO及BvM14-BADH在甜菜M14品系的葉片和根系中均顯著上調(diào)表達(dá)[10]。Kent等指出藜科植物如甜菜和菠菜，在鹽脅迫下積累甜菜堿，甜菜葉片和根系中BADH的活性隨鹽濃度從0升高到500mmol/L時(shí)都提高了2～4倍，同時(shí)可翻譯BADH的mRNA水平也呈增加趨勢(shì)[11]。絲氨酸是在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT）存在下由甘氨酸合成，在磷酸化途徑中衍生自3磷酸甘油酸（3-PGA），是細(xì)胞內(nèi)甲基化反應(yīng)中甲基的主要來(lái)源[12]，因?yàn)楹铣商鸩藟A的過(guò)程中需要甲基，所以絲氨酸在提供甲基方面是非常重要的。Kito等探討了甜菜絲氨酸生物合成基因應(yīng)對(duì)鹽脅迫的意義，他們共分離出4種基因，分別是存在于葉綠體中編碼D-3-磷酸甘油酸脫氫酶基因 （BvPGDHa和BvPGDHb）和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因（BvSHMTa和BvSHMTb），結(jié)果表明甜菜葉片和根系在鹽脅迫條件下，BvPGDHa的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯增強(qiáng)，而B(niǎo)vPGDHb的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯降低。另一方面，BvSHMTa在鹽脅迫下在葉片和根系中短暫表達(dá)，而B(niǎo)vSHMTb的表達(dá)水平?jīng)]有改變。鹽脅迫后，葉片、葉柄和根系的PGDH活性均顯著增加[13]。

1.2 抗氧化保護(hù)酶合成相關(guān)基因

鹽脅迫條件下，甜菜葉片抗氧化酶活性隨鹽濃度的增加而增加，如過(guò)氧化物酶（POX）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、交替氧化酶（AOX）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、質(zhì)體末端氧化酶（PTOX）[14-15]。Hossain等報(bào)道鹽度導(dǎo)致甜菜植株Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD3、所有AOX亞型、2-Cys-PrxB、PrxQ和PrxIIF的積累。相比之下，F(xiàn)e-SOD1、1-Cys-PrX、PrxIIB和PrxIIE水平隨鹽度升高而降低[15]。BVAPX是一種全長(zhǎng)cDNA編碼的過(guò)氧化物酶體抗壞血酸過(guò)氧化物酶。Dunajska-Ordak等人通過(guò)RT-Q-PCR分析表明，在長(zhǎng)期鹽度處理?xiàng)l件下，甜菜葉片BvAPX表達(dá)顯著增加，而在短期鹽處理期間BvAPX轉(zhuǎn)錄水平仍未受分離葉片的影響[16]。在甜菜基因組中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)AOX基因與擬南芥中的AtAOX1和AtAOX2高度相似，因此命名為BvAOX1A、BvAOX1B和BvAOX2，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與PTOX具有高同源性的蛋白編碼基因，分別命名為BvPTOX1和BvPTOX2。高效協(xié)調(diào)的上調(diào)AOX和PTOX可能代表甜菜在耐鹽脅迫過(guò)程中的一個(gè)特定特征。AtAOX1a的過(guò)表達(dá)降低了葉片中ROS的形成[17]。在高鹽度脅迫條件下，AOX有助于緩解氧化應(yīng)激[18]。轉(zhuǎn)錄上調(diào)AOX和PTOX參與抑制鹽脅迫甜菜中ROS積累[15]。

1.3 其他功能相關(guān)基因

沿海甜菜是一種比糖甜菜耐鹽的品種[19]，Uysal等人用功能基因組方法，篩選了先前建立的甜菜cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了BETA1，BETA1可能在將過(guò)量的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)膜系統(tǒng)中以降低細(xì)胞質(zhì)中有毒Na+的濃度[20]。孫宗艷利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)鹽脅迫下的甜菜幼苗根葉樣品進(jìn)行miR160/164及其靶基因和抗逆相關(guān)PSCS基因的表達(dá)量分析，結(jié)果表明鹽脅迫下PSCS基因的表達(dá)與處理時(shí)間呈正相關(guān)，而miR160/164的表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)并遵循一定的時(shí)空表達(dá)模式，其靶基因的表達(dá)均呈顯著上調(diào)變化[21]。谷丹等對(duì)鹽脅迫下甜菜采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明隨著鹽脅迫的增大，BvM14-SAMS2基因在葉片中的表達(dá)量升高，在根中的表達(dá)量不明顯，在甜菜M14品系根、莖、葉、花中的表達(dá)量為：根＞葉＞花＞莖[22]。張?jiān)佈┑葘?duì)鹽脅迫下甜菜M14葉片的3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)BvM14-ATPaseF、BvM14-ATPaseH、BvM14-saD經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量分析，結(jié)果表明，與未處理對(duì)照相比，200、400 mmol/L鹽濃度處理下BvM14-ATPaseF基因分別上調(diào)3.70與4.47倍，BvM14-ATPaseH基因在鹽脅迫處理下分別上調(diào)0.85與1.36倍，而B(niǎo)vM14-saD基因隨著鹽濃度的增加下調(diào)0.97與2.54倍，表明在鹽脅迫下不同基因具有的功能不同[23]。Kanhonou克隆了甜菜蛋白激酶CK2（BvCKA2）的催化亞基在酵母中進(jìn)行功能表達(dá)，表明BvCKA2能夠提高酵母對(duì)NaCl的耐受性[24]。王鵬等為了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BvNHX1基因在植物耐鹽中的作用，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pROKⅡ-BvNHX1轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)BvNHX1基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽能力[25]。谷丹等報(bào)道BvM14-SAMS2基因在甜菜M14品系葉片中受鹽脅迫后表達(dá)增強(qiáng)，推測(cè)該基因可能有利于甜菜植株免受鹽脅迫損害[22]。Wu等報(bào)道甜菜M14細(xì)胞系中BvM14-glyoxalase I基因在細(xì)胞解毒和耐受非生物脅迫中起重要作用[26]。趙晨曦報(bào)道甜菜M14中BvM14-Tpx基因可提高轉(zhuǎn)基因酵母的抗氧化及耐鹽能力[27]。

2 甜菜耐鹽性蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究植物耐鹽性，獲取植物耐鹽基因重要的手段之一。鹽脅迫下甜菜成熟葉片中誘導(dǎo)cmRNA亞基明顯增加，隨著mRNA的增加，V-ATP酶蛋白含量也增加[28]。李金娜從鹽脅迫下甜菜M14通過(guò)雙向電泳和溶液內(nèi)酶解兩個(gè)方法獲得差異磷酸化蛋白，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，200 mmol/L NaCl處理有24個(gè)差異的磷酸化蛋白，有16個(gè)得到成功鑒定，其中有8個(gè)磷酸化蛋白上調(diào)表達(dá)。與對(duì)照組相比，400 mmol/L NaCl處理有36個(gè)差異的磷酸化蛋白，有28個(gè)得到成功鑒定，其中17個(gè)磷酸化蛋白上調(diào)表達(dá)。后將對(duì)照組與NaCl處理組的蛋白質(zhì)樣品采用LC-MS/MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定出189個(gè)差異的磷酸化蛋白，94個(gè)磷酸化蛋白上調(diào)表達(dá)，95個(gè)磷酸化蛋白下調(diào)表達(dá)。將以上獲得鹽應(yīng)答差異磷酸化蛋白進(jìn)行功能分類，鑒定出的差異表達(dá)磷酸化蛋白參與代謝（16%）、運(yùn)輸（15%）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白激酶（14%）、轉(zhuǎn)錄（13%）、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（12%）、脅迫和防御（8%）、蛋白合成（7%）、光合作用（2%）、蛋白折疊和降解（3%）生物過(guò)程中[29]?？导覍幚胕TRAQ技術(shù)對(duì)鹽脅迫下甜菜M14品系根部膜蛋白質(zhì)進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，得到73個(gè)差異表達(dá)蛋白，為了進(jìn)一步研究鹽應(yīng)答膜蛋白，將根部鹽應(yīng)答膜蛋白進(jìn)行分類，分別是參與運(yùn)輸（32%）、多種生物進(jìn)程（10%）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（10%）、脅迫和防御（80%）、能量（8%）、降解（6%）、轉(zhuǎn)錄（6%）、代謝（5%）、合成（3%）、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（1%）和未知（11%）[30]。李鶴男通過(guò)對(duì)甜菜幼苗進(jìn)行高鹽誘導(dǎo)，經(jīng)DDRT-PCR技術(shù)和銀染技術(shù)分析，分離出甜菜高鹽誘導(dǎo)差異表達(dá)的片段共50條，其中上調(diào)15條，下調(diào)35條，并對(duì)Northem雜交呈陽(yáng)性的序列片段測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，共得到12條耐鹽相關(guān)cDNA片段，涉及葉綠體mRNA及tRNA、SOS信號(hào)通路蛋白cDNA、NADH脫氫酶cDNA等[31]。

3 提高甜菜耐鹽性的策略

3.1 選育耐鹽性甜菜材料

一般而言，不同的甜菜品種其耐鹽能力不同，所以，可以通過(guò)選育抗鹽性較強(qiáng)的甜菜品種（系）來(lái)提高甜菜耐鹽性。甜菜種子發(fā)芽率、鹽害系數(shù)、幼苗株高、單株葉面積、單株生物學(xué)產(chǎn)量、植株含水量等均可做為甜菜芽期耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)。1.0%鹽脅迫濃度可作為鑒定甜菜芽期耐鹽性的臨界濃度，1.8%為甜菜鹽脅迫的極限濃度；不同的甜菜品種耐鹽性強(qiáng)弱也不同[32-33]。土壤鹽漬化越嚴(yán)重，對(duì)供試植物的生長(zhǎng)抑制作用越大，植株正常生長(zhǎng)的臨界含鹽量是1.2%[34]。於麗華等以146份甜菜種質(zhì)材料為研究對(duì)象，在280 mmol/L NaCl脅迫條件下篩選出耐鹽性強(qiáng)弱的材料，再以初選出的材料為研究對(duì)象進(jìn)行復(fù)選。結(jié)果表明，3份耐鹽性弱的材料，分別是82號(hào)、25號(hào)和268號(hào)。同時(shí)對(duì)市面上出售的48個(gè)甜菜品種也進(jìn)行了初選，篩選出2份耐鹽性強(qiáng)的材料STl3092和TDl3829，2份耐鹽性弱的材料巴士森和H10474[35]。劉華君等以新疆糖區(qū)近年廣泛種植的14份甜菜品種為試驗(yàn)材料，在總鹽含量9.6 g/kg的中度鹽漬化土壤試驗(yàn)田中，對(duì)綜合保苗率、葉片質(zhì)膜透性、葉片功能期、含糖率、產(chǎn)量、收獲株數(shù)6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，初步得出KWS7125和HI0466兩品種的耐鹽性較好，更適宜在中度鹽漬化土壤上種植[36]。

Munns報(bào)道耐旱種群也被發(fā)現(xiàn)是耐鹽的，可能是由于對(duì)鹽分和干旱脅迫的生理適應(yīng)相似，因此耐旱性的提高也可能提高鹽堿地的產(chǎn)量[37]。Salekdeh等報(bào)道標(biāo)記輔助選擇（MAS）候選基因的鑒定可以大大提高甜菜抗旱育種的效率[38]，MAS在提高甜菜耐鹽性方面也能發(fā)揮重要作用。Abbasi報(bào)道分子標(biāo)記-數(shù)量性狀聯(lián)合可用于提高育種效率，特別是耐鹽度育種[39]。

3.2 提高甜菜耐鹽性的栽培策略

適宜的種植模式、密度、施肥和作物保護(hù)等實(shí)用的農(nóng)藝方法是提高鹽分脅迫下產(chǎn)量的最有效途徑[40]。在鹽漬化土壤中，通過(guò)地膜覆蓋加紙筒育苗移栽或者甜菜紙筒育苗起高壟移栽可提高甜菜的耐鹽性[41-42]。另一些天然的植物激素或者自身分泌的物質(zhì)與植物的抗鹽性有一定的關(guān)系，外源植物激素處理能明顯地改善甜菜的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)質(zhì)量[43]。在鹽脅迫下外源脫落酸（ABA）可誘導(dǎo)脯氨酸大量積累，緩解鹽分過(guò)多造成的滲透脅迫和離子脅迫，維持細(xì)胞膜完整性，從而減輕植物受到的鹽害[44]。外源赤霉素（GA3）在鹽脅迫下提高甜菜種子水分吸收、萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[45]。外源水楊酸（SA）可提高鹽脅迫下植物根系中CAT和APX活性，降低相對(duì)電導(dǎo)率，減少丙二醛（MDA）含量，增強(qiáng)甜菜植株對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)能力[46]。外源Ca2+可顯著提高鹽脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)多胺含量以及根系中可溶性蛋白的含量，增強(qiáng)根系中谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（TGase）的活性，緩解植物受到的鹽害[47]。蕓苔素內(nèi)酯和誘抗素能夠促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和植物的光合作用，提高作物抗逆性[48-49]。

在鹽濃度處理下，施加氮肥后甜菜的脯氨酸、可溶性糖、硝酸根離子和鈉離子等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累逐漸增多，滲透調(diào)節(jié)能力顯著提高，同時(shí)葉綠素含量、光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度以及單位葉面積的RuBP羧化酶的活性均提高，另外對(duì)甜菜的含糖率也有重要影響[50]。外源葡萄糖可以減輕甜菜幼苗生物量下降的趨勢(shì)，也可以增強(qiáng)甜菜的光合作用，提高可溶性糖、脯氨酸含量和SOD活性[51]。葉面噴施外源甜菜堿能有效提高甜菜幼苗葉片面積、幼苗生物量、葉片相對(duì)含水量、甜菜堿含量、葉綠素含量、光合作用和抗氧化能力，另外甜菜幼苗葉片中POX、CAT、SOD、ATPase活性增加[52]。外源脯氨酸比外源甜菜堿更能減輕鹽脅迫的危害，因?yàn)樗哂休^強(qiáng)的抗氧化酶活性[53]。在鹽脅迫條件下，液泡中的鈉可以替代鉀的滲透調(diào)節(jié)功能，增加甜菜葉片的甜菜堿含量和相對(duì)含水量，增加葉面積和氣孔數(shù)量提高甜菜的耐鹽性[54-55]。

綜上所述，外源脫落酸、赤霉素、水楊酸、Ca2+、蕓苔素內(nèi)酯、氮肥、葡萄糖、甜菜堿、脯氨酸等能夠通過(guò)增強(qiáng)生理過(guò)程提高甜菜的耐鹽性（圖1），因此在鹽堿土種植甜菜時(shí)可以通過(guò)噴施外源激素或者外源物質(zhì)以提高耐鹽性。

圖1 提高甜菜耐鹽性的策略Fig.1 Strategies to improve salt tolerance of sugar beet

3.3 轉(zhuǎn)基因方法

耐鹽性是受多個(gè)鹽脅迫反應(yīng)基因影響的多基因性狀，基因工程及其在耐鹽育種中的應(yīng)用是大多數(shù)研究項(xiàng)目的目標(biāo)之一。甜菜液泡Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)基因的過(guò)表達(dá)顯著提高了甜菜的耐鹽性[56]。Liu等將擬南芥中耐鹽基因AtNHX3轉(zhuǎn)移到甜菜中，結(jié)果表明甜菜根系產(chǎn)量和含糖增加，證明AtNHX3增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高鹽度的抗性[57]。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來(lái)源于E.coli的膽堿脫氫酶（CDH）基因和來(lái)源于擬南芥的Na+/H+antiport基因?qū)胩鸩思?xì)胞可使甜菜耐鹽性由1%～1.5%提高到2%～2.5%的NaCl濃度[58]。這些發(fā)現(xiàn)表明，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法對(duì)具有耐鹽能力的基因表達(dá)的操縱，使不同作物的耐鹽性提高并增加作物產(chǎn)質(zhì)量成為可能。

4 展望

甜菜作為重要的糖料作物，對(duì)糖料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起著重要作用，但嚴(yán)重的土壤鹽漬化限制了甜菜的產(chǎn)質(zhì)量，因此選育耐鹽性強(qiáng)的甜菜新品種是目前面臨的主要問(wèn)題。研究者們通過(guò)選育耐鹽性品種、雜交育種、完善栽培策略以及基因工程技術(shù)已經(jīng)開(kāi)展了大量的新品種（系）選育工作，雖然利用這些技術(shù)已經(jīng)獲得了一些甜菜耐鹽材料，但由于周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)、耗力等缺點(diǎn)，這些技術(shù)在選育耐鹽性品種（系）時(shí)受到一定的限制。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程技術(shù)成為研究育種方法熱點(diǎn)之一。目前，大量的研究報(bào)道利用基因工程技術(shù)獲得了耐鹽性甜菜新品系（品種），但這些研究只是基于實(shí)驗(yàn)室或溫室中的NaCl脅迫研究，而對(duì)于相應(yīng)品種的地區(qū)性研究較少；其次，植物的耐鹽性是受多基因控制的性狀，但是目前大多數(shù)的研究?jī)H關(guān)于單基因；另外，目前大多耐鹽性探討的報(bào)道都是在轉(zhuǎn)基因品系（品種）的發(fā)芽期或幼苗期，但是幼苗期植物的耐鹽性是否可以維持并穩(wěn)定遺傳還有待證實(shí)。