王 佳，李 麗，黎冰林，盧 鑫，王麗京，楊永霞

(1.廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州 510006； 2.廣東藥科大學(xué) 醫(yī)藥信息工程學(xué)院， 510006)

黑色素瘤是高度惡性的腫瘤，在腫瘤發(fā)生的早期就會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[1]。在我國，雖然黑色素瘤的發(fā)生率較低，但其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移預(yù)后很差，5年生存率低于5%[2]。侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特征，在腫瘤的治療過程中，阻止腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移尤為重要，這也是治療腫瘤成敗的關(guān)鍵因素。小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10具有高轉(zhuǎn)移特性，已被廣泛地用于研究腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程的相關(guān)參數(shù)，是研究腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的理想模型[3]。

越來越多的研究表明，機(jī)體體內(nèi)微環(huán)境的改變與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。TAM (腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞)被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移最為重要的細(xì)胞之一[6]。近幾年來的研究發(fā)現(xiàn)，TAM可以分泌多種炎癥因子、生長刺激因子、蛋白水解酶和一些細(xì)胞因子[7]，這些因子既能降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)，還能促進(jìn)腫瘤中血管的形成[8]。TAM可構(gòu)成實(shí)體瘤細(xì)胞群體的50% ～ 80%，TAM浸潤與乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、宮頸癌和肺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[9]。NF-κB活化因子1(NF-κB activator 1，Act 1)在機(jī)體免疫反應(yīng)的作用極為廣泛，是NF-κB和C/EBP介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)下游信號通路的重要分子[10]。而NF-κB 在炎癥、先天免疫和癌癥中起著至關(guān)重要的作用[11]，且NF-κB信號通路能促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和生存[12]。已有文獻(xiàn)表明NF-κB信號通路與腫瘤相關(guān)，且都強(qiáng)調(diào)了這種轉(zhuǎn)錄因子在癌癥研究中的重要性[13]。Act 1主要介導(dǎo)IL-17信號通路的活化并參與炎癥反應(yīng)。Welte等研究發(fā)現(xiàn)，IL-17能夠促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展[14]。此外已有研究發(fā)現(xiàn)，通過IL-17B/IL-17BR信號傳導(dǎo)，能夠促進(jìn)人的骨髓干細(xì)胞與乳腺癌腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。Act 1的缺少會(huì)抑制IL-17誘導(dǎo)的NF-κB通路被激活[16]。且通過小鼠過敏性哮喘模型發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞中Act 1的缺失能減輕IL-25引起的Th2型免疫反應(yīng)和肺部炎癥[17]。

鑒于NF-κB信號能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的生長，且巨噬細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。目前，Act 1在腫瘤中的作用研究很少。因此，本研究以巨噬細(xì)胞Act 1表達(dá)被靶向抑制的小鼠(anti-Act 1)為研究對象，采用尾靜脈注射B16-F10細(xì)胞，誘導(dǎo)小鼠肺轉(zhuǎn)移模型，探討巨噬細(xì)胞Act 1在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Anti-Act 1小鼠構(gòu)建于C57BL/6背景，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所構(gòu)建并贈(zèng)送[18]。6～8周齡雄性C57BL/6小鼠24只(體重18～22 g)從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2013-0002]購買，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)SPF級動(dòng)物中心[SYXK(粵)2017-0125]。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都是按照中國動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南及其他相關(guān)國際準(zhǔn)則進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)[動(dòng)物福利倫理審批號：gdpulac2017026]。小鼠惡性黑色素瘤B16-F10細(xì)胞系(B16,ATCC,CCL-247)從密歇根大學(xué)耿建國實(shí)驗(yàn)室獲得。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物anti-Act 1小鼠的鑒定

剪取anti-Act 1小鼠的尾部，提取DNA，PCR擴(kuò)增目的片段基因，PCR引物1:5′-CTG GTG CAG ACA GCC TAG CTG-3′，引物2： 5′-CCT GCG AGC TAAAGT CCT GGA-3′ (Invitrogen)，基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶為250 bp。對基因鑒定為陽性的小鼠，提取腹腔巨噬細(xì)胞，采用Western blot法檢測巨噬細(xì)胞上Act 1的表達(dá)情況?；瘜W(xué)發(fā)光顯影儀避光顯影和拍攝。實(shí)驗(yàn)所用抗體為Act 1 (Santa Cruz)、β-actin(Bioworld)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠惡性黑色素瘤B16-F10細(xì)胞系(B16,ATCC,CCL-247)在DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清、200 mg/mL鏈霉素和200 U/mL青霉素)，溫度37℃，5% CO2/95%的培養(yǎng)箱中維持生長。

1.2.3 體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移模型的建立

C57BL/6和anti-Act 1雄性小鼠各12只，分別設(shè)為對照組和實(shí)驗(yàn)組，參照Qi等[19]的方法建立體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移模型。將B16-F10細(xì)胞(1×105/0.2 mL)通過尾靜脈的注射方法，分別注射到C57BL/6和anti-Act 1的體內(nèi)。20 d后腹腔注射氯胺酮10 mg/kg、阿托品1 mg/kg、鹽酸西拉嗪20 mg/kg麻醉，頸部脫臼處死小鼠。

1.2.4 肺組織病理組織學(xué)觀察

處死C57BL/6和anti-Act 1小鼠后，取肺組織，平鋪在濾紙上，觀察肺組織轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)數(shù)。再將其置于4%的多聚甲醛液中固定過夜，脫水后石蠟包埋，切片，HE染色。顯微鏡下觀察肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移的情況。

1.2.5 免疫組化法檢測肺組織Ki67、CD45、CD68的表達(dá)

采用常規(guī)石蠟切片(3 μm)，通過Ki67(Abcam)、CD45 (Proteintech) 和CD68 (Proteintech) 對肺、肺轉(zhuǎn)移灶部位進(jìn)行特異性染色，顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的增殖情況和炎癥浸潤程度。石蠟切片脫蠟后，高溫高壓抗原修復(fù)8 min，3% H2O2-甲醇溶液中孵育30 min，10% BSA阻滯1 h，切片用兔抗鼠Ki67(Abcam)、CD45 (Proteintech) 和CD68 (Proteintech) 進(jìn)行抗體孵育，4℃過夜，孵育二抗(兔抗，中杉金橋)，DAB染色，蘇木素復(fù)染。光學(xué)顯微鏡拍攝并記錄分析。并運(yùn)用免疫熒光法檢測肺組織轉(zhuǎn)移灶上巨噬細(xì)胞Act 1的表達(dá)情況，熒光顯微鏡避光拍攝。實(shí)驗(yàn)所用抗體為兔抗鼠CD68 (Proteintech)、Act 1 (Santa Cruz)、FITC(Life Technologies)標(biāo)記二抗。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析

對上述所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 anti-Act 1小鼠的鑒定

Anti-Act 1小鼠基因鑒定的目的條帶為250 bp，如圖1 A所示?；蜩b定為陽性的小鼠，提取腹腔巨噬細(xì)胞，提取細(xì)胞的蛋白，采用Western blot技術(shù)檢測Act 1的表達(dá)，結(jié)果如圖1B所示，與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞中Act 1的表達(dá)有明顯的下調(diào)趨勢。

2.2 靶向抑制巨噬細(xì)胞Act 1對小鼠肺轉(zhuǎn)移的影響

造模20 d后，處死小鼠。解剖取材，肉眼大體觀察肺組織的轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果如圖2所示，與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠肺表面轉(zhuǎn)移灶較少。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具有明顯的下調(diào)趨勢且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。通過HE染色，在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)移灶，證實(shí)了它們與B16細(xì)胞的同源性。

圖1 (A) Anti-Act 1 小鼠基因型鑒定；(B) Western blot 技術(shù)檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Act 1的表達(dá)Figure 1 (A) Genotype characterization of the anti-Act 1 mice；(B) Act 1 expression in peritoneal macrophages as determined by western blotting

注：與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠體內(nèi)肺結(jié)節(jié)數(shù)減小，**P<0.01。圖2 C57和anti-Act 1小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移的情況(×10)Note.Compared with C57 mice, the number of lung nodules in anti-Act 1 mice were decreased, **P< 0.01.Figure 2 Comparison of lung metastasis in the lung tissues of C57 and anti-Act 1 mice

2.3 靶向抑制巨噬細(xì)胞Act 1對小鼠肺組織B16-F10腫瘤細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞增殖指數(shù)是評價(jià)腫瘤嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素，Ki67可以反映細(xì)胞增殖的情況。免疫組化的結(jié)果如圖3所示，與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠的Ki67的表達(dá)量明顯減少。通過統(tǒng)計(jì)增殖指數(shù)(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))，結(jié)果顯示anti-Act 1小鼠的腫瘤細(xì)胞增殖程度低于C57小鼠，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.01)。

注：與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠體內(nèi)Ki67表達(dá)量下降，**P< 0.01。圖3 C57和anti-Act 1小鼠肺部腫瘤細(xì)胞增殖情況(×10)Note.Compared with C57 mice, the expression of Ki67 in the anti-Act 1 micewere decreased, **P< 0.01.Figure 3 Tumor cell proliferation in the metastatic lung lesions of C57 and anti-Act 1 mice

2.4 靶向抑制巨噬細(xì)胞Act 1對小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤的影響

免疫組化的結(jié)果如圖4所示，白細(xì)胞標(biāo)記物CD45和巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68主要表達(dá)于肺轉(zhuǎn)移灶的腫瘤實(shí)質(zhì)部位。與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠的CD45和CD68的表達(dá)量明顯減少，且均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.01)。結(jié)果提示，白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移部位的浸潤數(shù)量明顯減小。免疫熒光的結(jié)果如圖5所示，在C57小鼠肺轉(zhuǎn)移灶中，Act1與巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物CD68均有表達(dá)，且有大量共定位；然而，在anti-Act 1小鼠中，兩者的共定位甚少。進(jìn)一步證明，在anti-Act 1小鼠的巨噬細(xì)胞上Act 1的表達(dá)被靶向抑制了，且此類巨噬細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移部位的浸潤數(shù)量明顯減小。

3 討論

腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，就會(huì)對包括化療、放療和免疫療法在內(nèi)的大多數(shù)療法產(chǎn)生耐藥性。遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者預(yù)后極差，中位生存時(shí)間僅為8個(gè)月[20]。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡最主要的原因之一。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞所處環(huán)境有密切關(guān)聯(lián)，腫瘤微環(huán)境涉及多種免疫細(xì)胞和炎癥因子，巨噬細(xì)胞參與其中且與多種腫瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[21]。Act 1作為IL-17信號通路必需的銜接蛋白，可與IL-17RA和TRAF6形成復(fù)合體，活化NF-κB等信號通路[22]。本研究利用巨噬細(xì)胞Act 1表達(dá)被靶向抑制的小鼠(anti-Act 1)為研究對象，探討與研究了與NF-κB活化相關(guān)的Act 1對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的影響。

注：與C57小鼠相比，anti-Act 1小鼠體內(nèi)CD45、CD68表達(dá)量均下降，**P< 0.01。圖4 C57和anti-Act 1小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤情況(×20)Note.Compared with C57 mice, the expressions of CD45 and CD68 were decreased in anti-Act 1 mice, **P< 0.01.Figure 4 Inflammatory cell infiltration in the lung tissues of C57 and anti-Act 1 mice

圖5 免疫熒光法檢測小鼠肺轉(zhuǎn)移灶中巨噬細(xì)胞與Act 1的共表達(dá)情況(×20)Figure 5 Act 1 expression in the lung-resident macrophages. Immunofluorescence staining

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在B16-F10的人工肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，與C57小鼠相比，Anti-Act 1小鼠可顯著抑制轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目，同時(shí)通過HE染色，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Anti-Act 1小鼠的轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織面積小，片狀壞死部位少，提示靶向抑制巨噬細(xì)胞Act 1的表達(dá)，具有抗惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。細(xì)胞增殖指數(shù)是評價(jià)腫瘤嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素，ki67可以反映細(xì)胞增殖情況。在anti-Act 1小鼠的肺部轉(zhuǎn)移灶的腫瘤部位，ki67的表達(dá)量明顯降低，表明抑制巨噬細(xì)胞Act 1的表達(dá)能明顯抑制腫瘤轉(zhuǎn)移部位的細(xì)胞增殖。Anti-Act 1小鼠腫瘤的惡化程度較低，這也進(jìn)一步說明了抑制巨噬細(xì)胞Act 1的表達(dá)能在一定程度上減慢腫瘤細(xì)胞向肺轉(zhuǎn)移的速度。腫瘤組織中TAM浸潤與腫瘤發(fā)展以及不良預(yù)后相關(guān)，TAM可分泌TNF-α、EGF、IL-6等因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與存活[23]。同時(shí)，也觀察到，在腫瘤轉(zhuǎn)移灶部位及其周圍，白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤明顯減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制巨噬細(xì)胞Act 1的表達(dá)，能夠減緩腫瘤微環(huán)境中炎癥細(xì)胞的浸潤。

綜上所述，靶向抑制巨噬細(xì)胞Act 1的表達(dá)具有抗黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，這種效應(yīng)可能是由于抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲性和增殖能力，減弱了炎癥因子的浸潤能力。本研究結(jié)果為臨床上抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療提供了理論基礎(chǔ)。但其抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制還有待深入研究。