馮麗潔，李 俊

(南京信息工程大學(xué)體育部，南京 210044)

血管并發(fā)癥是糖尿病致殘、致死的主要原因，動脈粥樣硬化是引起血管并發(fā)癥的直接原因。研究顯示，氧化應(yīng)激在血管損傷及動脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[1]。糖尿病狀態(tài)下高血糖和脂質(zhì)代謝紊亂對血管內(nèi)皮的損傷主要是通過氧化應(yīng)激實現(xiàn)的。因此，降低氧化應(yīng)激對防止血管內(nèi)皮損傷，預(yù)防和治療血管并發(fā)癥具有十分重要意義。

目前對糖尿病的臨床治療主要以控制血糖為主，二甲雙胍是治療2型糖尿病最常用的雙胍類藥物，具有降低血糖，改善胰島素抵抗，降低氧化應(yīng)激等作用[2]。除了臨床干預(yù)外，生活方式改變尤其是運動已被認(rèn)為是預(yù)防和治療2型糖尿病的推薦方法。規(guī)律性有氧運動可以調(diào)節(jié)血糖代謝，提高機體抗氧化能力，降低慢性炎癥，對心血管具有保護作用[3]，但其作用效果還并不十分明確。本研究擬通過對2型糖尿病大鼠進行8周二甲雙胍和有氧運動干預(yù)，評價二甲雙胍、有氧運動及兩者聯(lián)合干預(yù)對2型糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠，6周齡共46只，體重220～270 g，由吳氏實驗動物中心提供[SCXK(閩)2012-0001]，飼養(yǎng)在福建師范大學(xué)實驗動物中心[SYXK(閩)2015-0004]。環(huán)境溫度：22oC ～24℃，濕度：50%～70%，光照：12 h∶12 h。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食。隨機抽取6只作為正常對照組，并給予正常飼料喂養(yǎng)，其余大鼠用于制作2型糖尿病模型。實驗過程按照實驗動物的使用3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

二甲雙胍(上海生工生物工程公司)；胰島素(insulin)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)Elisa試劑盒(南京建成生物工程研究所)；NADPH 氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4, NOX4)4抗體、GADPH抗體、核因子相關(guān)因子2(nuclear factor-e2-related factor 2, Nrf2)抗體、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)抗體(Abcam 英國)；超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。低溫高速離心機(Eppendorf 德國)；血糖儀(羅氏 美國)；凝膠電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽(Bio-Rad 美國)；凝膠電泳成像分析儀(ProteinSimple美國)；酶標(biāo)儀(Tecan美國)；分光光度計(Bio-Rad美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 2型糖尿病模型構(gòu)建

采用高脂飲食，小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病模型。40只大鼠高脂飼料(15%蔗糖，15%豬油，5蛋黃粉，0.2%膽酸鈉，64.8%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)四周后，禁食12 h，腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液；劑量30 mg/kg)[4-5]，正常對照組注射相應(yīng)容量的檸檬酸緩沖液。STZ注射2周后，空腹血糖值持續(xù)大于11.1 mmol/L，確定為2型糖尿病模型，最終符合糖尿病模型大鼠共32只。

1.3.2 實驗分組

將大鼠分為5組：正常對照組(NC, n=6)；糖尿病對照組(DC, n=7)；糖尿病運動組(DS, n=9)，有氧運動干預(yù)；糖尿病二甲雙胍干預(yù)組(DM, n=7)，進行二甲雙胍處理；糖尿病二甲雙胍+運動聯(lián)合干預(yù)組(DMS, n=9)，同時給予二甲雙胍和有氧運動處理。干預(yù)時間共8周。

1.3.3 給藥方法

二甲雙胍溶入飲水中給予大鼠攝取，藥物劑量參考已有的研究[6]，第1周劑量為150 mg/(kg·d)，第2周為300 mg/(kg·d)，第3周調(diào)整為450 mg/(kg·d)，該劑量一直保持到實驗結(jié)束。監(jiān)控大鼠體重和飲水量變化，每周根據(jù)體重變化調(diào)整一次藥物劑量。

1.3.4 運動方案

運動組大鼠采用游泳運動方式，每天1 h，每周5 d，共8周。1～4周大鼠無負(fù)重進行游泳，5～8周負(fù)重1%體重(重物系尾部)。游泳池為圓形塑料桶(直徑60 cm×高75 cm)，水深不低于45 cm，水溫控制在32℃～34℃，每桶同時容納3只大鼠。時刻監(jiān)控大鼠游泳狀況，以防大鼠溺水。

1.3.5 樣本制備

最后一次運動結(jié)束后24 h處死。血液樣本以4℃， 3500 r/min離心10 min，取上清液，-20℃保存。迅速剝離主動脈，取小部分放入4%多聚甲醛中固定，其余放置-80℃冰箱中保存待用。

1.3.6 生化指標(biāo)檢測

大鼠禁食12 h后尾部取血，使用血糖儀和試紙檢測大鼠血糖濃度。采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清insulin、TNF-α和VCAM-1濃度。

1.3.7 病理標(biāo)本制備

從固定液中取出主動脈組織，進行脫水、透明和石蠟包埋。組織切片4 μm，脫蠟復(fù)水、HE染色、脫水、透明、樹膠封片，最后顯微鏡拍照。

1.3.8 大鼠血管組織SOD和MDA檢測

將主動脈按1∶9比例加入生理鹽水研磨制作組織勻漿液；然后采用BCA法測量勻漿液的蛋白濃度，最后按照試劑盒檢測說明書進行操作，并根據(jù)公式計算出組織勻漿液SOD活性和MDA濃度。

1.3.9 Western blotting

先提取主動脈總蛋白并檢測蛋白濃度。95℃加熱變性后放入-80℃ 保存?zhèn)溆?。制備分離膠和濃縮膠，上樣，打開電源，直到溴酚藍(lán)到達(dá)電泳槽底部。電泳完成后轉(zhuǎn)膜1.5 h。轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉1 h， 4℃ 孵育過夜，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光顯色、拍照，并進行蛋白條帶灰度檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠血糖代謝相關(guān)指標(biāo)

圖1顯示了8周干預(yù)后大鼠血糖代謝指標(biāo)變化。從圖中看出，糖尿病大鼠空腹血糖(FBG)均顯著高于正常組(P<0.01)，其中DC組空腹血糖值最高，DM和DMS組大鼠空腹血糖顯著低于DC組(P<0.01)。DC組空腹胰島素(FINS)顯著高于NC組(P<0.01)，DS、DM和DMS組與DC組相比，空腹胰島素有了明顯的降低(P<0.01)。

2.2 大鼠主動脈血管形態(tài)

鏡下觀察顯示8周干預(yù)后大鼠主動脈的結(jié)構(gòu)形態(tài)(圖2)。NC組大鼠主動脈內(nèi)壁光滑，內(nèi)皮細(xì)胞完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊。DC組與NC組相比，血管內(nèi)壁粗糙，內(nèi)皮細(xì)胞破損相對嚴(yán)重，平滑肌細(xì)胞排列凌亂。DS、DM和DMS組血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定程度的損傷，但與DC組相比，血管病變有所緩解，其中DMS組大鼠主動脈結(jié)構(gòu)保持相對完整。

注：與NC組比較，aP<0.05, AP<0.01；與DC組比較，b P<0.05, BP<0.01。圖1 大鼠空腹血糖和空腹胰島素Note. Compared with the NC group, aP<0.05, AP<0.01；compared with the DC group,b P<0.05, BP<0.01.Figure 1 Fasting blood glucose and fasting insulin levels in the rats

圖2 大鼠主動脈的病理改變(HE染色,×200)Figure 2 Histological changes of the rat aortas(HE staining)

2.3 大鼠血管Nrf2、HO-1、SOD指標(biāo)

圖3顯示了8周二甲雙胍和有氧運動干預(yù)后大鼠血管抗氧化水平。從圖A中可以看出，NC和DC組Nrf2蛋白表達(dá)較低，而DS、DM、DMS組表達(dá)顯著性升高(P<0.01)，給予二甲雙胍處理的兩個組Nrf2表達(dá)水平均高于DS組，其中DMS組與DS組相比，具有統(tǒng)計意義(P<0.05)。從圖B中看出，DC組血管HO-1蛋白表達(dá)顯著低于NC組(P<0.01)。三組干預(yù)組表達(dá)水平均顯著高于DC組(P<0.01)，DM和DMS組HO-1蛋白表達(dá)水平不僅高于DC組，而且還明顯高于NC和DS組(P<0.01，P<0.05)。圖C顯示了大鼠血管SOD水平。DC組SOD水平最低，三個干預(yù)組SOD水平均高于DC組，其中DS和DMS組SOD水平與DC組相比具有統(tǒng)計性意義(P<0.05)。

注：A:Nrf2蛋白表達(dá)；B:HO-1蛋白表達(dá)；C:SOD活性。與NC組比較，aP<0.05, AP<0.01；與DC組比較，bP<0.05, BP<0.01；與DS組比較，c P<0.05, C P<0.01。圖3 大鼠主動脈組織中的Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)和SOD活性Note. A, Protein expression of Nrf2; B, Protein expression of HO-1; C, Activity of SOD. Compared with the NC group, aP<0.05, AP<0.01. Compared with the DC group, bP<0.05, BP<0.01. Compared with the DS group,cP<0.05, CP<0.01.Figure 3 The expression of Nrf2 and HO-1 proteins and activity of SOD in the rat aorta tissues

2.4 大鼠血管NOX4和MDA指標(biāo)

圖4反映了糖尿病大鼠血管氧化水平。從圖A中可以看出，糖尿病組血管NOX4蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對照組(P<0.01,P<0.05)，其中，DC組表達(dá)量最高。三組干預(yù)組NOX4表達(dá)水平均顯著低于DC組(P<0.01)，其中DM組最低，與DS組相比，有統(tǒng)計性差異(P<0.05)。從圖B可以看出，DC組血管組織MDA水平明顯高于NC照組(P<0.05)。8周干預(yù)后，DM組和DMS組血管MDA水平均顯著低于DC組(P<0.05)。DS組MDA水平低于DC組，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 大鼠血清TNF-α和VCAM-1指標(biāo)

注：A:NOX4蛋白表達(dá)，B:MDA濃度. 與NC組比較，aP<0.05, AP<0.01；與DC組比較，bP<0.05, BP<0.01；與DS組比較，c P<0.05,C P<0.01。圖4 大鼠主動脈組織中的NOX4蛋白表達(dá)和MDA濃度Note. A, Protein expression of NOX4. B, Concentration of MDA. Compared with the NC group, aP<0.05, AP<0.01. Compared with the DC group, bP<0.05, BP<0.01. Compared with the DS group,cP<0.05,C P<0.01.Figure 4 Expression of NOX4 protein and concentration of MDA in the rat aorta tissues

注：與NC組比較，aP<0.05, AP<0.01；與DC組比較，bP<0.05, BP<0.01；與DS組比較，c P<0.05,C P<0.01;與DM組比較，d P<0.05,D P<0.01。圖5 大鼠血清TNF-α和VCAM-1濃度Note. Compared with the NC group, aP<0.05, AP<0.01. Compared with the DC group, bP<0.05, BP<0.01. Compared with the DS group,cP<0.05, CP<0.01.Figure 5 Serum concentrations of TNF-α and VCAM-1 in the rats

圖5顯示了大鼠血清炎癥標(biāo)志物度濃度水平。從圖中可以看出所有糖尿病組TNF-α濃度均高于正常對照組，其中，DC組濃度最高。三個干預(yù)組TNF-α濃度都有下降的趨勢，其中，DS組明顯低于DC組(P<0.05)，DMS組TNF-α濃度最低，并顯著低于其他三個糖尿病組(P<0.05，P<0.01)。為了進一步了解主動脈血管炎癥狀態(tài)，對大鼠血清VCAM-1濃度進行了檢測，糖尿病大鼠血清VCAM-1濃度明顯高于正常對照組(P<0.01)，其中DC組最高。DS、DM和DMS組VCAM-1水平都明顯低于DC組(P<0.01，P<0.05)，其中DS和DMS組水平明顯低于DM組(P<0.05)。

3 討論

大量的研究表明，有氧運動可以改善糖尿病患者胰島素抵抗，降低血糖[7-10]，美國糖尿病協(xié)會已將運動作為治療糖尿病的推薦方法[11]。本實驗研究結(jié)果顯示，二甲雙胍和有氧運動均可以降低糖尿病大鼠空腹血糖，但聯(lián)合干預(yù)的控糖效果更為顯著。二甲雙胍主要是通過抑制肝臟糖異生作用，增加外周組織對胰島素敏感性來控制血糖。有氧運動可以增加骨骼肌含量，促進骨骼肌對對血糖的吸收，除此之外，運動過程中肌源性IL-6濃度增加能夠刺激GLUT4轉(zhuǎn)運，促進外周組織對葡萄糖的吸收[12]。二甲雙胍與有氧運動聯(lián)合干預(yù)在降低胰島素水平，提高胰島素敏感性上的效果要優(yōu)于單純二甲雙胍或有氧運動的治療效果，說明二甲雙胍和有氧運動可能分別通過不同的信號途徑來提高胰島素敏感性，從而使得聯(lián)合干預(yù)在改善胰島素敏感性具有疊加效應(yīng)。

在脈管系統(tǒng)中，氧化應(yīng)激與許多血管損傷的病理過程有關(guān)，過多的ROS能夠?qū)е卵馨l(fā)生紊亂。本實驗研究顯示，二甲雙胍和有氧運動均能有效緩解糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷，這可能與降低血糖和血管氧化應(yīng)激有關(guān)。NOX4是心血管系統(tǒng)中ROS最主要的來源之一，其主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[13]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，多種細(xì)胞應(yīng)激包括血流切應(yīng)力，糖基化蛋白，TNF-α等都可以上調(diào)NOX4表達(dá)，NOX4增加反過來損傷內(nèi)皮細(xì)胞[14]。本實驗研究顯示，糖尿病對照組大鼠血管NOX4蛋白表達(dá)比正常組高達(dá)接近3倍的水平，MDA濃度也顯著高于正常組。8周二甲雙胍和有氧運動干預(yù)下調(diào)血管NOX4蛋白表達(dá)水平，同時MDA水平也同步下降，說明二甲雙胍和有氧運動可能通過降低血管NOX4表達(dá)以及MDA水平來緩解血管氧化應(yīng)激。二甲雙胍同樣具有抗氧化功能，Sato等[15]研究顯示二甲雙胍可以通過抑制NOX4來緩解肺纖維化的發(fā)展。但本實驗研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，給予二甲雙胍處理組大鼠NOX4表達(dá)明顯低于運動組，而運動和聯(lián)合干預(yù)也并沒有比二甲雙胍干預(yù)產(chǎn)生更好的效果，運動可能反而阻礙了二甲雙胍的抗氧化效用。這是否與運動激活機體的氧化系統(tǒng)有關(guān)，這還需要進行進一步的實驗研究。

Nrf2是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的重要調(diào)節(jié)器，與內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，促進下游NQO1、HO-1、SOD等抗氧化酶基因的表達(dá)[16]。除此之外，Nrf2還能通過其下游HO-1發(fā)揮對血管的保護作用。本實驗研究顯示，二甲雙胍和有氧運動不僅上調(diào)糖尿病大鼠血管Nrf2蛋白水平，同時還增加了下游因子HO-1蛋白表達(dá)和SOD活性，說明二甲雙胍和有氧運動可能激活糖尿病大鼠血管Nrf2/ARE信號通路。目前研究已經(jīng)證明運動能夠提高機體抗氧化能力，且許多研究認(rèn)為運動的抗氧化效應(yīng)可能是通過Nrf2實現(xiàn)的[17]，本研究結(jié)果與之前研究較為相似。近年來許多報道顯示了二甲雙胍的抗氧化特性[18]。Zhou等[19]研究發(fā)現(xiàn)給予4周二甲雙胍處理能明顯上調(diào)胰島素抵抗小鼠肝臟和骨骼肌Nrf2及NQO1和HO-1蛋白表達(dá)。因此，可以推測，二甲雙胍與有氧運動可能通過激活Nrf2信號及下游抗氧化酶基因表達(dá)來增加糖尿病大鼠血管抗氧化能力。

氧化應(yīng)激在許多疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用。糖尿病狀態(tài)下長期高血糖誘導(dǎo)機體產(chǎn)生過多的ROS，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時激活相關(guān)炎癥信號通路，促進VCAM-1和TNF-α等炎癥基因的表達(dá)，促使血管發(fā)生病變[20-21]。研究數(shù)據(jù)顯示，二甲雙胍和有氧運動均能有效降低糖尿病大鼠血清TNF-α和VCAM-1濃度。VCAM-1主要表達(dá)于血管組織，是血管炎癥的主要標(biāo)志[22]，說明二甲雙胍和有氧運動能夠緩解糖尿病大鼠血管炎癥。近年來有證據(jù)表明，二甲雙胍除了具有調(diào)節(jié)血糖平衡外，還能夠降低炎癥[23-24]。長期有氧運動能夠促進肌源性IL-6的分泌，改善循環(huán)血液的抗炎環(huán)境[25]。二甲雙胍與有氧運動的抗炎作用主要是通過降低氧化應(yīng)激途徑實現(xiàn)，這與上述的研究結(jié)果一致。

綜上所述，二甲雙胍和有氧運動能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖代謝平衡，緩解糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。二甲雙胍和有氧運動可能是通過激活Nrf2信號，增加下游抗氧化酶表達(dá)，抑制NOX4表達(dá)，降低ROS生成來降低糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激。