李長(zhǎng)龍,陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是一類人為控制繁殖方式并具有特殊遺傳組成的動(dòng)物群體，一般分為同基因型(近交系)和異基因型(封閉群)動(dòng)物。近交系動(dòng)物是經(jīng)連續(xù)20代(或以上)的全同胞兄妹交配(或親代與子代交配)培育而成，近交系數(shù)大于99%，基因純合度達(dá)98.6%以上。同一品系的動(dòng)物由于始于共同祖先，具有基因型和表型的一致性，因而主要的生物學(xué)特性相同，個(gè)體間近于無(wú)差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)也趨于一致，因此，只需用少量的動(dòng)物，即可得到非常規(guī)律的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而封閉群動(dòng)物則是以非近親交配方式進(jìn)行繁殖生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群，要求在不從其外部引入新個(gè)體的條件下，至少連續(xù)繁殖4代以上。這使得封閉群動(dòng)物的遺傳組成具有一定的雜合性和穩(wěn)定性，它類似于人類群體遺傳組成的異質(zhì)性，在人類遺傳研究、藥物篩選和毒性試驗(yàn)等方面有重要作用。顯而易見(jiàn)，在近交系動(dòng)物生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中就十分重視動(dòng)物的均一性，而封閉群動(dòng)物個(gè)體間則強(qiáng)調(diào)其多樣性。但在實(shí)際工作中，由于多種原因可以導(dǎo)致動(dòng)物的遺傳基因或基因頻率的改變，使同一品種品系的動(dòng)物與原始品種品系出現(xiàn)了明顯的遺傳差異，個(gè)體間的均一性大大降低。遺傳質(zhì)量問(wèn)題主要發(fā)生在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)過(guò)程中，不但影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生產(chǎn)，還對(duì)研究結(jié)果的真實(shí)性、穩(wěn)定性和重復(fù)性產(chǎn)生極大影響。因此，如何發(fā)現(xiàn)和處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題就顯得十分重要。

本課題組前期研究中利用N-甲基亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)4家公司購(gòu)買的C57BL/6 J小鼠建立胸腺淋巴瘤模型。盡管所用MNU的劑量和給藥方法均參照了多數(shù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道[1]，但4批C57BL/6 J小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻差異極大，死亡率在3.3%～91.7%不等，胸腺淋巴瘤模型成功率0～56.6%(表1)。應(yīng)用42個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)上述群體動(dòng)物進(jìn)行遺傳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物在群體間和群體內(nèi)均有微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)多態(tài)現(xiàn)出現(xiàn)，表明群體存在遺傳質(zhì)量問(wèn)題[2]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專業(yè)技術(shù)人員和醫(yī)學(xué)生是未來(lái)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的執(zhí)行者、管理者和監(jiān)督者，在培訓(xùn)和教學(xué)過(guò)程中強(qiáng)化遺傳質(zhì)量控制的意識(shí)非常重要。本文結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和應(yīng)用動(dòng)物進(jìn)行科學(xué)研究的實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，就如何發(fā)現(xiàn)、分析和處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量事件，強(qiáng)化相關(guān)人員的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制意識(shí)，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量，提高動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的真是性和準(zhǔn)確性。

1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題的發(fā)現(xiàn)與處理

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量是影響研究結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，但是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題具有滯后性和隱蔽性，加之多數(shù)科研人員對(duì)此重視程度不夠或沒(méi)有意識(shí)到，使得遺傳質(zhì)量對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響往往被低估。盡管如此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題仍常見(jiàn)于報(bào)道之中。學(xué)者認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳組成不同是很多生物學(xué)和醫(yī)藥相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大或無(wú)法重復(fù)的主要原因[3]?？茖W(xué)研究中由于應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量不好而出現(xiàn)的常見(jiàn)問(wèn)題主要表現(xiàn)為動(dòng)物對(duì)同樣的實(shí)驗(yàn)處理反應(yīng)不一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異很大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏真實(shí)性、無(wú)法重復(fù)，甚至出現(xiàn)違背常理現(xiàn)象[4]。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題的處理方法

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)異常或?qū)嶒?yàn)結(jié)束后結(jié)果差異較大時(shí)，在排除其他影響因素的情況下，應(yīng)考慮是否存在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題。如果發(fā)現(xiàn)個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問(wèn)題時(shí)，可以考慮淘汰有問(wèn)題的動(dòng)物，重新補(bǔ)充新的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)出現(xiàn)有較多動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題時(shí)，須淘汰所有動(dòng)物，從其他生產(chǎn)單位重新購(gòu)入動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？紤]到樣本和時(shí)間因素，最好先從小樣本預(yù)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，之后再擴(kuò)大樣本。當(dāng)懷疑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在遺傳質(zhì)量問(wèn)題時(shí)，可以活體采取少量組織(尾或血液)提取基因組DNA，用微衛(wèi)星或SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析結(jié)果判定是否存在遺傳質(zhì)量問(wèn)題而采取相應(yīng)的措施。

表1 不同群體小鼠模型制作結(jié)果比較

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中遺傳質(zhì)量控制注意事項(xiàng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前應(yīng)首先了解動(dòng)物生產(chǎn)供應(yīng)單位情況，選擇管理規(guī)范、注重質(zhì)量、信譽(yù)良好并且在同類實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用較多的單位采購(gòu)。也可以通過(guò)向做過(guò)同類實(shí)驗(yàn)的同行進(jìn)行咨詢。了解生產(chǎn)供應(yīng)單位最近一次遺傳檢測(cè)時(shí)間和結(jié)果，要求生產(chǎn)供應(yīng)單位提供遺傳質(zhì)量檢測(cè)報(bào)告。動(dòng)物購(gòu)入后應(yīng)檢查動(dòng)物外觀，包括毛色、體型、采食量和飲水量是否一致，不合格動(dòng)物不能編入實(shí)驗(yàn)組。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)中動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題的發(fā)現(xiàn)與處理

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)中常見(jiàn)的動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量改變有的并不表現(xiàn)出可見(jiàn)的表性特征，需要進(jìn)行特殊的實(shí)驗(yàn)室檢查才能發(fā)現(xiàn)。但多數(shù)情況下通過(guò)細(xì)心觀察或多代繁殖后會(huì)顯現(xiàn)出可見(jiàn)或可感知的異常變化。一般可觀察到的與遺傳質(zhì)量有關(guān)的變化如下幾個(gè)方面，在外部表型特征方面(包括：毛色、眼睛、尾巴、乳頭數(shù)、生殖器、牙齒、耳和四肢等)、繁殖特性(包括：妊娠率、產(chǎn)子數(shù)、胎間隔、離乳率、食仔、拒絕哺乳、死胎或畸形等)、生長(zhǎng)發(fā)育特性(包括：初生重、離乳重、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)等)以及生理生化等指標(biāo)等。對(duì)于外部特征沒(méi)有顯著變化的遺傳質(zhì)量改變，只能通過(guò)定期的遺傳質(zhì)量檢測(cè)才能發(fā)現(xiàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)中遺傳質(zhì)量問(wèn)題產(chǎn)生的可能原因分析

近交系動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題通常有以下原因。首先，種源問(wèn)題。目前應(yīng)用的近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系大多來(lái)源于國(guó)外，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)原則上從國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心引種后進(jìn)行繁育，多數(shù)單位自行保種繁殖。如果種子動(dòng)物遺傳質(zhì)量出現(xiàn)了問(wèn)題而未被發(fā)覺(jué)，將會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)的動(dòng)物遺傳質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題。第二，繁殖方式問(wèn)題。近交系動(dòng)物的核心種群必須采用全同胞近親繁殖，在生產(chǎn)群體中則可采用隨機(jī)交配的方式進(jìn)行，但限于繁殖4代之后全部淘汰，不得留種。如果生產(chǎn)群隨機(jī)交配超過(guò)4個(gè)世代，動(dòng)物遺傳質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題的概率將大大增加。第三，遺傳污染。很多近交系動(dòng)物在外部形態(tài)特征上很難區(qū)分，如果飼養(yǎng)管理稍有疏忽將可能導(dǎo)致不同近交系動(dòng)物雜交，進(jìn)而出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問(wèn)題。此外，雜合基因顯現(xiàn)、基因突變、保種時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等原因也能引起近交系動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題。

封閉群動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題的原因主要有以下幾個(gè)方面。首先，封閉群動(dòng)物種群規(guī)模過(guò)小導(dǎo)致近交系上升過(guò)快(每代超過(guò)1%)，群體出現(xiàn)近親繁殖而導(dǎo)致近交衰退。第二，繁殖方式不合理。由于繁殖方式不合理(非隨機(jī)交配或循環(huán)交配)導(dǎo)致近親繁殖，從而出現(xiàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量下降。第三，引種不規(guī)范。一般小型嚙齒類動(dòng)物引種有效規(guī)模不小于25對(duì)，如果引種規(guī)模過(guò)小則導(dǎo)致近交系數(shù)過(guò)快上升，易于出現(xiàn)近親繁殖現(xiàn)象。此外，外部動(dòng)物種群進(jìn)入、選種指標(biāo)不完善、選擇壓力過(guò)大、生產(chǎn)記錄管理混亂等也是出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問(wèn)題的重要因素。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)中動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題的處理方法

當(dāng)僅有個(gè)別動(dòng)出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問(wèn)題時(shí)，對(duì)無(wú)培育和應(yīng)用價(jià)值的異常動(dòng)物進(jìn)行淘汰。如果出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問(wèn)題的動(dòng)物具有培育和應(yīng)用價(jià)值，如有某種疾病表型，則應(yīng)找到同窩(最好有相同表型)動(dòng)物或親代進(jìn)行繁殖，觀察其是否具有遺傳性，固定其表型，進(jìn)而建立新的模型動(dòng)物種群。當(dāng)多數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問(wèn)題時(shí)，則應(yīng)首先對(duì)有問(wèn)題的動(dòng)物進(jìn)行抽樣檢測(cè)。針對(duì)近交系群體主要進(jìn)行一致性檢測(cè)，明確遺傳質(zhì)量問(wèn)題。對(duì)個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)多態(tài)性差異，應(yīng)對(duì)其親代動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)后淘汰這一支的所有動(dòng)物。較多動(dòng)物出現(xiàn)不均勻的改變時(shí)，淘汰種群，重新引種。對(duì)于封閉群動(dòng)物主要進(jìn)行均勻性檢測(cè)以確定群體內(nèi)是否處于平衡狀態(tài)，與原群體是否存在差異。如有較大差異，查找原因，是否有新的動(dòng)物引入，是否種群過(guò)小。對(duì)問(wèn)題較多的種群要進(jìn)行淘汰，重新引種并封閉繁育4代以上。

2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)中控制動(dòng)物遺傳質(zhì)量應(yīng)注意事項(xiàng)

遺傳質(zhì)量控制貫穿于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，引種、繁育、保種和生產(chǎn)中均應(yīng)嚴(yán)格控制。首先，要從國(guó)家正規(guī)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心引種，種用動(dòng)物要具有明確的品種品系背景資料、遺傳組成、遺傳檢測(cè)報(bào)告及主要生物學(xué)特性等。第二，飼養(yǎng)人員要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化管理和操作培訓(xùn)，考核合格后方可以上崗；飼養(yǎng)人員要善于及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題并解決問(wèn)題。第三，生產(chǎn)過(guò)程嚴(yán)格生產(chǎn)記錄制度，保證生產(chǎn)記錄完整，包括品系名稱、繁殖代數(shù)(系譜)、繁殖方式、繁殖狀況、生長(zhǎng)發(fā)育狀況、異常發(fā)生情況等。第四，根據(jù)不同品種品系動(dòng)物的遺傳

特征定期進(jìn)行遺傳檢測(cè)，其中近交系動(dòng)物應(yīng)保持遺傳均質(zhì)性和基因單態(tài)性，封閉群動(dòng)物應(yīng)保持遺傳異質(zhì)性和基因多態(tài)性并保證近交系數(shù)每代上升不超過(guò)1%。第四，動(dòng)物生產(chǎn)單位應(yīng)建立規(guī)范的活體保種和冷凍保種體系，防止種源發(fā)生遺傳質(zhì)量事故。

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量是保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的重要因素，但在實(shí)際工作中由于動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題產(chǎn)生的效果延遲和難于發(fā)現(xiàn)等原因，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量問(wèn)題長(zhǎng)期存在。另外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)管理者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用者每當(dāng)談到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量時(shí)，更多地重視實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)質(zhì)量，往往忽略遺傳質(zhì)量問(wèn)題。實(shí)際上遺傳質(zhì)量與微生物質(zhì)量一樣都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生重要影響，遺傳質(zhì)量控制某種程度上甚至比微生物質(zhì)量控制更重要。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題不但導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)群體的質(zhì)量下降，而且也是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法重復(fù)的重要原因[5]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專業(yè)技術(shù)人員培訓(xùn)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物教學(xué)過(guò)程中培養(yǎng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制的意識(shí)是十分必要的。在培訓(xùn)和教學(xué)過(guò)程中通過(guò)理論和實(shí)例的講解，強(qiáng)化對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制重要性的認(rèn)識(shí)，培養(yǎng)他們善于發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量問(wèn)題，找出問(wèn)題的根源，提出解決問(wèn)題的辦法。