孫一涵，毛愛華，王強(qiáng)

(1. 中國科學(xué)院動物研究所，膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101； 2. 河北省安國中學(xué)，河北 保定 071200)

造血干細(xì)胞是一群維持生命體正常生理功能所必需的多能造血祖細(xì)胞，隨著發(fā)育進(jìn)行，可以生成各種成熟的血細(xì)胞，包括：紅細(xì)胞、髓系細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。造血作用指造血祖細(xì)胞經(jīng)過增殖、分化最終形成成熟的血細(xì)胞過程。脊椎動物胚胎造血在進(jìn)化上高度保守，斑馬魚和哺乳動物胚胎造血類似，根據(jù)造血的時間和位置以及生成細(xì)胞的特征，可分為初級造血(primitive hematopoiesis)和次級造血(definitive hematopoiesis)兩個階段[1]。在斑馬魚胚胎中，初級造血中心大約形成于胚胎受精后18 hpf (hours post-fertilization)，位于胚胎脊索腹側(cè)軀干區(qū)域的中間細(xì)胞團(tuán)(intermediate cell mass，ICM)。斑馬魚胚胎的中間細(xì)胞團(tuán)類似于哺乳動物的卵黃囊，能夠產(chǎn)生造血干細(xì)胞、紅細(xì)胞前體細(xì)胞等。這些細(xì)胞隨著血液循環(huán)的開始進(jìn)入循環(huán)體系，生成紅細(xì)胞，為胚胎發(fā)育提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。斑馬魚次級造血過程與哺乳動物類似，其起源也與哺乳動物類似，均起始于主動脈腹側(cè)壁，也稱為主動脈-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonephros，AGM)區(qū)域，產(chǎn)生造血干細(xì)胞并分化為各種成熟的血細(xì)胞[2]。因此，以斑馬魚研究造血發(fā)育以及藥物篩選所獲得的發(fā)現(xiàn)和結(jié)論，對于研究哺乳類甚至人類的造血作用都具有十分重要的借鑒作用。

三七是我國名貴中藥，屬于五加科人參屬。三七的根莖和花均可用藥，三七根中提取的有效活性成分是三七總皂苷(Panax notoginsenosides，PNSs)，主要包括三七皂苷、黃酮、蛋白氨基酸及非蛋白的多糖、甾醇等成分[3]。三七總皂苷具有良好的止血、活血化瘀、消炎止痛等功效，近年來也用作心血管疾病的藥物，用于治療冠心病、心律失常等[4-5]。目前關(guān)于PNSs的藥理學(xué)研究主要針對成體小鼠模型以及體外培養(yǎng)的細(xì)胞系[6-8]。關(guān)于PNSs是否影響胚胎造血作用，目前并不清楚。因此，本文以斑馬魚胚胎為研究對象，用不同濃度的PNSs處理，觀察是否影響斑馬魚胚胎造血發(fā)育，為三七的藥理學(xué)應(yīng)用和價值開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)所用的野生型斑馬魚(Daniorerio)為Tuebingen品系，斑馬魚胚胎用含Holfreter水(0.05 g/L KCl, 0.1 g/L CaCl2, 0.2 g/L NaHCO3, 3.5 g/L NaCl)的培養(yǎng)皿于28.5℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器

三七粉(河北康派中藥材有限公司)，聯(lián)甲氧基苯胺(O-dianisidine)，冷凍離心機(jī)，激光共聚焦顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 三七總皂苷提取

本實(shí)驗(yàn)采用乙醇提取法獲得PNSs，方法參照文獻(xiàn)[9]。準(zhǔn)確稱取4 g三七粉，置于100 mL的錐形瓶中，加入40 mL 70%乙醇，采用熱回流提取 3 次，每次 30 min。然后合并所獲得的上清，蒸發(fā)濃縮至一定體積，通過冷凍離心干燥，獲得1.23 g干粉，得率為30.75%。用DMSO溶解這些粉末，配成100 mg/mL的母液，-20℃保存，備用。

1.2.2 藥物濃度的確定

用Holfreter水稀釋PNSs母液，設(shè)置4個濃度梯度，依次為25、50、100、250 μg/mL。對照組胚胎用含0.25%的DMSO 的Holfreter水培養(yǎng)。將受精后發(fā)育至75%外包的胚胎置于6孔板內(nèi)，每孔放入約40枚胚胎，觀察受精后24 h胚胎的發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)胚胎延遲發(fā)育和死亡率。

1.2.3 斑馬魚胚胎處理

收集受精后發(fā)育至75%外包的胚胎置于六孔板，按照(1.2.2)中探究好的PNSs濃度梯度給藥處理，28.5℃恒溫培養(yǎng)箱遮光培養(yǎng)。每隔12 h更換藥物，然后置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。收集發(fā)育至相應(yīng)時期的胚胎，用于原位雜交、O-dianisidine (聯(lián)甲氧基苯胺)染色以及活體拍照等。

1.2.4 斑馬魚整胚原位雜交

整胚原位雜交中所用探針采用Roche公司生產(chǎn)的地高辛(DIG) 標(biāo)記，探針的合成參考說明書。原位雜交所需要的試劑及其配制方法和具體的操作步驟參照文獻(xiàn)[10]。

1.2.5 聯(lián)甲氧基苯胺染色

聯(lián)甲氧基苯胺能夠特異性的標(biāo)記紅細(xì)胞中的血紅蛋白。通過聯(lián)甲氧基苯胺染色可以檢測斑馬魚胚胎中血紅蛋白的表達(dá)，從而驗(yàn)證PNSs在造血過程中對紅細(xì)胞生成的作用。實(shí)驗(yàn)試劑的配制和實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[11]，收集發(fā)育至48 hpf的胚胎，脫膜后用 Holfreter 水重復(fù)洗兩次。吸去 Holfreter水，加入聯(lián)甲氧基苯胺染液室溫下遮光染色。

2 結(jié)果

2.1 藥物濃度確定

為了探索PNSs作用于斑馬魚胚胎的最佳實(shí)驗(yàn)濃度，我們進(jìn)行了濃度梯度實(shí)驗(yàn)。收集受精后發(fā)育至75%外包的胚胎，分成五組，分別為DMSO處理的對照組和25、50、100、250 μg/mL的PNSs處理組。待胚胎發(fā)育至受精后24 h，觀察胚胎發(fā)育情況。結(jié)果如圖1A所示，低濃度的PNSs處理后，對胚胎形態(tài)無明顯影響；但是當(dāng)濃度達(dá)到250 μg/mL，大部分胚胎發(fā)育明顯滯后或卵黃發(fā)黑死亡。如圖1B所示，統(tǒng)計(jì)分析三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，25 μg/mL至100 μg/mL PNSs處理組，胚胎幾乎發(fā)育正常，而250 μg/mL處理組，60%以上的胚胎發(fā)育受阻或者死亡。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要選擇25、50和100 μg/mL濃度梯度進(jìn)行處理，研究PNSs對斑馬魚胚胎造血發(fā)育的影響。

注：A. 用不同濃度的PNSs從75%外包開始處理斑馬魚胚胎，觀察發(fā)育至受精后24 h的胚胎形態(tài)；B. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不同濃度梯度處理后斑馬魚胚胎發(fā)育延遲或者死亡率。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來自三次生物學(xué)重復(fù)。圖1 不同濃度的PNSs對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響Note. A. Zebrafish embryos were treated with different concentrations of PNSs from 75% epiboly stage, and embryo morphology was observed at 24 hpf. B. After treatment of zebrafish with different concentration of PNSs, embryonic development delay or mortality rate was statistically analyzed. All measurements were performed in triplicate.Figure 1 Effects of different concentrations of PNSs on the embryonic development of zebrafish

2.2 PNSs處理導(dǎo)致造斑馬魚初級造血缺陷

通過摸索三七總皂苷濃度梯度，我們確定了以25、50、100 μg/mL濃度的PNSs梯度處理斑馬魚胚胎，沒有明顯的毒副作用。因此，我們分別用25、50、100 μg/mL的PNSs，從75%外包開始處理胚胎，待其發(fā)育至受精22 h后，通過整胚原位雜交技術(shù)檢測初級造血紅細(xì)胞特異性標(biāo)記基因gata1和hbbe3在ICM區(qū)的表達(dá)。與對照組相比，25 μg/mL處理組胚胎gata1和hbbe3的表達(dá)均略有減少，而50和100 μg/mL處理組的胚胎gata1和hbbe3的表達(dá)均明顯降低(圖2A和2B)。這些結(jié)果說明PNSs處理抑制了斑馬魚胚胎的初級造血發(fā)育。由于50和100 μg/mL 的PNSs抑制效果比較明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用這兩個濃度梯度處理胚胎。

為了進(jìn)一步確認(rèn)PNSs對斑馬魚初級造血的影響，我們通過聯(lián)甲氧基苯胺染色實(shí)驗(yàn)檢測了受精后48 h的斑馬魚胚胎中紅細(xì)胞的生成情況。與對照組相比，50和100 μg/mL PNSs處理的胚胎紅細(xì)胞明顯減少，且100 μg/mL處理組的胚胎抑制效果更顯著(圖2C)。這些結(jié)果證明，PNSs對斑馬魚胚胎初級造血發(fā)育有抑制作用，而且其濃度越高，抑制作用越明顯。

注：A-B. 不同濃度PNSs從75%外包開始處理胚胎，在受精后22 h檢測初級造血的分子標(biāo)記基因gata1和hbbe3的表達(dá)；C. 聯(lián)甲氧基苯胺染色檢測受精后48 h的斑馬魚胚胎中紅細(xì)胞的發(fā)育。圖2 PNSs抑制斑馬魚胚胎初級造血Note. A-B. Embryos were treated with different concentrations of PNSs from 75% epiboly stage, and the expression of primitive hematopoietic marker genes gata1 and hbbe3 were detected at 22 hpf. C. O-Dianisidine staining was used to detect the development of erythrocytes of 48 hpf zebrafish embryos.Figure 2 PNSs inhibited the primitive hematopoiesis of zebrafish embryos

注：A-B. 不同濃度PNSs從75%外包開始處理胚胎，在受精后26 h (A) 和36 h (B)通過原位雜交檢測斑馬魚胚胎造血干細(xì)胞的分子標(biāo)記runx1和cmyb的表達(dá)。圖3 PNSs抑制斑馬魚的造血干細(xì)胞生成Note. A-B. Embryos were treated with different concentrations of PNSs from 75% epiboly stage, and the expressions of molecular marker genes runx1 and cmyb in zebrafish embryo hematopoietic stem cells were detected by in situ hybridization at 26 hpf (A) and 36 hpf (B).Figure 3 PNSs inhibited the zebrafish hematopoietic stem cells

2.3 PNSs影響造血干細(xì)胞生成

在斑馬魚胚胎受精后24 h，位于AGM區(qū)域主動脈腹側(cè)壁的生血內(nèi)皮通過內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生造血干細(xì)胞，繼而起始次級造血。為了探討PNSs對胚胎次級造血的影響，我們檢測了造血干細(xì)胞的分子標(biāo)記runx1和cmyb的表達(dá)。與對照組相比，在受精后26 h，50 μg/mL PNSs處理的胚胎，runx1和cmyb均無明顯變化，但是100 μg/mL處理顯著抑制runx1和cmyb表達(dá)(圖3A)，說明在造血干細(xì)胞產(chǎn)生初期，PNSs就已經(jīng)對次級造血產(chǎn)生影響。當(dāng)胚胎發(fā)育至36 hpf時，高濃度PNSs的抑制作用更加明顯，runx1和cmyb的表達(dá)均顯著下調(diào)(圖3B)。這些結(jié)果表明，PNSs處理抑制斑馬魚胚胎次級造血。

2.4 PNSs影響T細(xì)胞生成

在斑馬魚中，造血干細(xì)胞在 AGM 出現(xiàn)后，遷移至尾部造血組織進(jìn)行增殖擴(kuò)張。部分造血干細(xì)胞遷移至胸腺后分化為T淋巴細(xì)胞。因此通過檢測胸腺內(nèi) T淋巴細(xì)胞的生成可以反映造血干細(xì)胞發(fā)育。我們檢測了T淋巴細(xì)胞標(biāo)記基因rag1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)處理組胚胎rag1幾乎不表達(dá)(圖4)。這些結(jié)果同樣證明，PNSs對胚胎的次級造血具有較強(qiáng)的抑制作用。

2.5 PNSs對胚胎血管形成沒有明顯影響

我們觀察到PNSs處理后導(dǎo)致造血干細(xì)胞生成明顯減少。由于HSC來源于AGM 區(qū)主動脈腹側(cè)壁的內(nèi)皮細(xì)胞，我們猜想造血干細(xì)胞發(fā)育缺陷可能與主動脈血管發(fā)育受阻相關(guān)。因此，接下來我們觀察了特異性標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因品系Tg(kdrl:eGFP)胚胎在36 hpf AGM區(qū)血管的發(fā)育情況。與我們的推測不同，50和100 μg/mL PNSs處理的胚胎血管形成并未發(fā)生明顯變化(圖5)。因此，PNSs并不是通過影響血管的發(fā)育而間接抑制造血干細(xì)胞生成。

注：不同濃度PNSs處理胚胎后，原位雜交檢測受精后第3天T淋巴細(xì)胞分子標(biāo)記rag1的表達(dá)。圖4 PNSs抑制T淋巴細(xì)胞生成Note. After treatment of the embryos with different concentrations of PNSs, the expression of T lymphocyte molecular marker rag1 was detected by in situ hybridization at 3 dpf.Figure 4 PNSs inhibit the T lymphocyte formation

圖5 活體觀察不同濃度PNSs處理胚胎后36 hpf AGM區(qū)血管結(jié)構(gòu)(比例尺：200 μm)Figure 5 Vascular structure of AGM region of the 36 hpf embryos was observed in vivo after treatment with different concentrations of PNSs(Scale bar=200 μm)

3 討論

近年來，利用斑馬魚作為模式生物探討中藥的臨床功能的相關(guān)研究越來越多，對中藥的開發(fā)利用、中藥有效成分的篩選以及中藥作用機(jī)制的闡明具有巨大的促進(jìn)作用[12]。本文以斑馬魚為動物模型來研究PNSs對胚胎造血的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PNSs對斑馬魚胚胎初級造血和次級造血均有抑制作用，且這種抑制效果具有濃度依賴性。通過活體觀察，我們發(fā)現(xiàn)50和100 μg/mL PNSs處理胚胎，整體發(fā)育并沒有受到明顯影響，但是紅細(xì)胞的生成受到嚴(yán)重抑制，說明初級造血受到影響。然而，PNSs影響初級造血的具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

在AGM區(qū)檢測HSC的分子標(biāo)記runx1和cmyb，低濃度的PNSs處理后并沒有明顯變化，但濃度達(dá)到100 μg/mL時，次級造血在起始階段就有缺陷，造血干細(xì)胞生成減少，而且胸腺中HSC分化產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞也受到抑制。PNSs處理的胚胎血管發(fā)育正常，說明PNSs可能通過影響動脈內(nèi)皮向HSC轉(zhuǎn)化而直接調(diào)控造血干細(xì)胞生成，而不是通過影響血管發(fā)育而間接抑制次級造血。

在體外實(shí)驗(yàn)中，PNSs具有生血功能，調(diào)控與造血細(xì)胞增殖、分化相關(guān)基因的表達(dá)[13]。本研究通過用PNSs處理斑馬魚胚胎，發(fā)現(xiàn)PNSs對胚胎期造血發(fā)育具有抑制作用，為三七藥物的合理有效使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們的結(jié)果提示，在孕期可能需要慎重使用三七總皂苷藥物。