王興童，孟興，佟相慧，陳洪巖，韓凌霞

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物與比較醫(yī)學團隊，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室，哈爾濱 150069)

抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運體(transporter associated with antigen processing，TAP)是由 TAP1 和 TAP2 亞基形成的異二聚體跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，負責將內(nèi)源性抗原肽轉(zhuǎn)運給主要組織相容性抗原(major histocompatibility complex, MHC)I 類分子，最終引發(fā)細胞免疫應(yīng)答[1-2]。Tap基因位于多種動物基因組的 MHC 核心區(qū)域，雞[3]和鴨[4]的Tap基因均與MHC I 類分子毗鄰。Tap基因具有高度多態(tài)性，是影響機體免疫遺傳學特征的關(guān)鍵分子，例如不同人群對黑色素瘤[5]或鼻咽癌[6]的易感性可能與Tap基因的等位基因型相關(guān)。

無特定病原體(specific pathogen free, SPF)鴨是目前國內(nèi)唯一的水禽類實驗動物，經(jīng)過分子遺傳學分析[7]、組織學分析[8]、疫病敏感性試驗[9]、群體遺傳學[10]、解剖學數(shù)據(jù)測定[11]和生理生化數(shù)據(jù)[12]等多項生物學特性測定，性能穩(wěn)定，已廣泛用于水禽病的致病機理和防控措施研究。MHC 單倍型是國際上培育近交系禽類動物的主要靶基因[13]。其中，以tap1 和tap2 基因組序列純合子為基礎(chǔ)選育出的4個單倍型 SPF 鴨品系——命名為HBW-B1、B2、B3和B4[14]，是研究水禽病中TAP-MHC I 類分子途徑相關(guān)免疫遺傳機制的良好實驗材料。

為了有利于深入研究 TAP蛋白在抗病毒感染中的作用，本研究以HBW-B2 系TAP2 蛋白的肽結(jié)合區(qū)原核表達產(chǎn)物為免疫原[15]，制備特異性單抗，并分析其與其他常見農(nóng)業(yè)實驗動物的免疫學反應(yīng)特異性，以期為水禽病免疫遺傳學研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SP2/0 骨髓瘤細胞由本實驗室保存；表達鴨 TAP2 蛋白肽結(jié)合區(qū) (PBD) 保守區(qū)域的重組質(zhì)粒 pET-TAP2PBD以 pET-30a為載體，插入了HBW-B2鴨的TAP2 PBD，由本課題組構(gòu)建[15]； SPF級 BALB/c 雌鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司【SCXK(遼)2015-0001】，封閉群 HBW-SPF 鴨(2周齡麻鴨和封閉群 BWEL-SPF 雞(8周齡，白來航雞)【SCXK(黑)2017-005】以及封閉群 SPF 長白豬由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供【SCXK(黑)2015-004】；無異常臨床癥狀的鵪鶉和鵝購自農(nóng)貿(mào)市場。SPF雞和鴨的外周血由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所【SCXK(黑)2011-007】提供；鵪鶉、鵝和豬的組織學樣品由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物感染實驗設(shè)施實施【SYXK(黑)2017-009】；十二指腸組織的石蠟切片制備和免疫組化檢測由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所病理組完成。動物實驗的福利與倫理審批號為IACUC-2017-0056。

1.1.2 試劑

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS) 購自Gibco公司；HRP 標記的山羊抗鼠 IgG (IgG-HRP)、FITC 標記山羊抗小鼠 IgG (IgG-FITC) 抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IR Dye 800CW 標記的驢抗小鼠 IgG 抗體購自 LI-COR 公司；SBA Clonotyping System-HRP Kit 購自Southern Biotech 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物免疫

以終濃度為 1 mmol/L IPTG 誘導表達含有重組質(zhì)粒 pET-TAP2PBD 的大腸埃希菌 BL21(DE3)。表達產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化，再用 100 mmol/L 咪唑純化。純化后的蛋白樣品送上海啟研生物科技有限公司進行質(zhì)譜鑒定。經(jīng)SDS-PAGE 電泳。0.25 mol/L KCL 溶液染色后，切下含有外源蛋白的膠條，碾碎。腹腔注射 7 周齡 BALB/c 雌性小鼠，每隔1周免疫。第 3 次免疫后1周加強免疫，按常規(guī)方法與SP2/0 細胞融合、篩選并擴大培養(yǎng)。

1.2.2 雜交瘤細胞篩選、腹水的制備及亞型鑒定

利用純化的TAP蛋白包被ELISA板，采用間接 ELISA 法篩選對TAP蛋白有強反應(yīng)性的陽性雜交瘤細胞。對穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞三次克隆化，篩選穩(wěn)定表達細胞株。取10 周齡雌性 BALB/c 小鼠，腹腔注射液體石蠟 0.5 mL/只，7 d 后腹腔注射 0.5 mL 含105個對數(shù)生長期的單克隆陽性細胞。每天觀察2次，及時采集腹水。將腹水 10 000 r/min 離心 5 min，取上清，-20℃ 保存。根據(jù) SBA Clonotyping System-HRP Kit 產(chǎn)品說明書，對腹水中的抗體分子進行重鏈和輕鏈亞型的鑒定。

1.2.3 單抗的 Western blot 鑒定

將 IPTG 誘導前、后的 TAP2 PBD 原核表達產(chǎn)物及 pET-30a 空載體轉(zhuǎn)化菌進行 SDS-PAGE 電泳，半干法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。5% 脫脂乳封閉。以 1A6 腹水(1∶100 稀釋)為一抗，室溫作用 1 h，PBST 洗滌 3 次，5 min/次；以 IR Dye 800CW 標記驢抗小鼠 IgG(1∶8000 稀釋)為二抗，室溫于搖床上避光作用 45 min，PBST 洗滌 3 次，5 min/次。使用奧德賽紅外掃描儀顯色。

1.2.4 單抗對雞和鴨外周血淋巴細胞的間接免疫熒光抗體試驗(IFA)試驗

翅靜脈分別采集雞和鴨抗凝血 2 mL，分別用雞外周血淋巴分離液和鴨外周血淋巴分離液分離淋巴細胞。將分離到的細胞分散到96孔細胞板，用 4%多聚甲醛固定 30 min。PBS 洗滌，1000 g 離心 10 min，棄上清。用含 0.1% Triton 100 的 PBS 重懸細胞，37℃ 作用10 min。2000 r/min 水平離心 5 min，棄上清。洗滌3次。以 1∶100 稀釋的腹水為一抗，37℃ 作用 1 h。同上洗滌三次。以 1∶200 稀釋的 FITC 標記山羊抗鼠 IgG 為二抗，37℃ 孵育 40 min。洗滌三次。用 200 μL PBS 重懸細胞，適量分散于 96 孔細胞板，倒置熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 不同農(nóng)業(yè)實驗動物的免疫組化檢測

將 BWEL-SPF 雞、HBK-SPF 鴨、SPF 長白豬、市售鵪鶉和鵝的十二指腸石蠟組織切片，置于甲醇和 0.3% H2O2的緩沖液中去除內(nèi)源性過氧化物酶，8%脫脂乳溶液封閉。以 1A6 腹水(1∶10)為一抗，4℃過夜孵育。用 SPF 級 BALB/c 小鼠血清檢測 SPF 鴨為陰性對照。次日用 TBS 緩沖液洗滌，以山羊抗鼠 IgG-HRP (1∶400) 為二抗，37℃ 孵育1 h。洗滌，于含 H2O2的 DAB 顯色液中顯色，光學顯微鏡觀察。

1.2.6 單抗對鴨腸組織的免疫電鏡檢測結(jié)果

實驗材料為 3 周齡 HJD-SPF 鴨免疫鴨瘟疫苗后感染強毒 CSC 株的大腸組織，由本團隊趙麗麗老師和牛銀杰博士惠贈，免疫電鏡的檢測由本單位電鏡組完成。簡言之， 將大腸組織用2.5% 戊二醛固定 2 h，用 0.1 mol/L PBS漂洗 3 次，每次 15 min。加入 1% 鋨酸于 4℃ 固定 2 h；再次漂洗 3 次；用 50%、70%、90% 和 100% 丙酮于 4℃ 各脫水 15 min，最后室溫脫水 10 min。加入 Epon812 樹脂，室溫浸透過夜，包埋。 80℃ 聚合 48 h后修片，切片厚度為 50～70 nm。醋酸鈾 15 min 和檸檬酸鉛 10 min 分別染色，室溫干燥后觀察。用以 1A6 腹水(1∶10)為一抗，4℃ 過夜孵育。1∶200 稀釋的 FITC 標記山羊抗鼠 IgG 為二抗，37℃ 孵育 1.5 h。透射電子顯微鏡(日立H-7650)觀察。

1.2.7 單抗抗原表位的鑒定

根據(jù) NCBI 登錄的鴨Tap2 基因組序列(MH209635)，設(shè)計合成三對引物，以 pET-TAP2PBD 質(zhì)粒為模板，分別 PCR 擴增Tap2 的 1-198、148-327 和 241-429 核苷酸片段，克隆入原核表達載體 pET-32a，誘導表達 TAP2 蛋白的 A1-K66、F50-L109和F81-V143三段。利用 TAP 單抗腹水分別進行 Western blot 分析。根據(jù)反應(yīng)結(jié)果，再將 1-198 核苷酸片段按 1-75、46-123 和 94-198 分別擴增、克隆，誘導表達 A1-A25、N16-I41和 G32-K66三段，再次進行 Western blot 分析。所用引物序列見表1。具有 Western blot 反應(yīng)性的最小氨基酸片段，作為抗原表位。

1.2.8 抗原表位序列分析

對得到的表位氨基酸序列與 NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLAST，并分析序列同源性。

2 結(jié)果

2.1 TAP2單克隆雜交瘤細胞的篩選、腹水的制備及亞型鑒定

將純化、回收的 TAP 重組蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，根據(jù)Mascot算法，得分從94(EOA93744.1)- 46(XP_012955427.1)的蛋白共有6個，分值最高的是鴨TAP2蛋白序列(AKN20813.1)，達106，均為綠頭鴨TAP2蛋白序列。經(jīng)過優(yōu)化，確定ELISA方法的蛋白最佳包被濃度為1.25 μg/mL，OD450值大于等于1.0為陽性細胞株。經(jīng)3次亞克隆，獲得單克隆雜交瘤細胞株 1A6。腹水的亞型鑒定試劑盒檢測結(jié)果分別為IgA 0.224，IgG1 0.246，IgG2a 0.151，IgG2b 0.157，IgM 1.638，lambda 0.176，Kappa 0.7，因此確定1A6重鏈為 IgM 型，輕鏈為 Kappa 鏈。

表1 表位鑒定所用引物序列Table 1 Primer sequences used for epitope identification

注：A, B：1A6檢測鴨PBL；C, D: PBS檢測鴨PBL；E, F：1A6檢測雞PBL；G, H: PBS檢測雞PBL。圖2 外周血淋巴細胞IFA檢測結(jié)果Notes. A, B: Duck peripheral blood lymphocytes tested with 1A6; C, D: Duck peripheral blood lymphocytes tested with PBS; E, F: Chicken peripheral blood lymphocytes tested with 1A6; G, H: Chicken peripheral blood lymphocytes tested with PBS.Figure 2 IFA results of peripheral blood lymphocytes

2.2 單抗的Western blot檢測

以1A6為一抗，對 pET-TAP2PBD 表達蛋白進行 Western blot 檢測。見圖1，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，與誘導的pET-30a 載體菌蛋白(1)和未誘導的重組菌蛋白(3)相比，重組菌在 22×103處出現(xiàn)明顯外源條帶(2)，分子量22×103，大小與理論值符合。Western blot 檢測結(jié)果表明，腹水能特異性地與重組菌誘導蛋白反應(yīng)(2)，與載體對照菌(1)和未誘導重組菌無特異性反應(yīng)(3)。

注：M: 蛋白質(zhì)標準；1. 誘導的pET-30a；2. 誘導的重組菌；3. 未誘導的重組菌。圖1 pET-TAP2PBD重組菌Western blot 檢測結(jié)果Note. M: Protein marker. 1, Induced pET-30a bacteria. 2, Induced pET-TAP2PBD recombinant bacteria. 3, Non-induced pET-TAP2PBD bacteria.Figure 1 Western blot analysis of pET-TAP2PBD recombinant bacteria

2.3 對鴨和雞外周血淋巴細胞的 IFA 結(jié)果

對鴨和雞外周血淋巴細胞的 IFA 檢測結(jié)果顯示，在明場下觀察，同視野中的細胞數(shù)量和形態(tài)較好；在暗視野下，1A6 可以在兩種淋巴細胞上檢測到特異性綠色熒光，熒光強度沒有明顯差異； PBS 對兩種細胞都沒有顯色。見圖2。

2.4 不同動物的免疫組化檢測

1A6對 SPF鴨、SPF雞、鵪鶉、鵝和豬十二指腸組織的石蠟切片的免疫組化檢測結(jié)果顯示，在鴨(圖3A)和雞(圖3B)腸道的固有層檢測到強特異性信號，與鵪鶉(圖3D)、鵝(圖3E)和 SPF 豬(圖3F)未出現(xiàn)特異性顯色，用SPF小鼠血清檢測鴨組織作為對照(圖3C)。

2.5 鴨瘟免疫攻毒鴨的免疫電鏡檢測結(jié)果

免疫電鏡結(jié)果顯示，正常鴨和免疫攻毒組鴨大腸組織細胞內(nèi)均可明顯檢測到特異的金顆粒，如箭頭所示，主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少量表達在核膜和核內(nèi)靠近核孔的部位。受到病原刺激的鴨腸組織中金顆粒的數(shù)量明顯多于正常鴨。 見圖4。

注：A：鴨；B：雞；C：鴨；D：鵪鶉；E：鵝；F：豬. A、B、D、E和F以1A6為一抗，C以小鼠血清為一抗。箭頭表示陽性反應(yīng)位置。圖3 1A6對不同農(nóng)業(yè)動物十二指腸的免疫組化檢測結(jié)果Notes. A, Duck; B, Chicken; C, Duck; D, Coturnix; E, Goose; F, Swine. A, B, D, E, F were detected using 1A6 as primary antibody. C was used SPF mice serum. Arrows indicate the sites of positive reaction.Figure 3 Immunohistochemical results of 1A6 in the duodenal tissue of different agricultural animals

注：A. 免疫-攻毒鴨腸壁細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；B. 正常鴨腸組織細胞的細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；C. 免疫-攻毒鴨腸壁細胞的細胞核。箭頭表示免疫金顆粒。圖4 免疫電鏡結(jié)果Note. A. Endoplasmic reticulum of duck intestinal wall cells in the immune-challenge group. B. Nucleus and endoplasmic reticulum of normal duck intestinal tissue cells. C. Nucleus of intestinal endothelium cell in the immune-challenged duck. Arrows indicate immunogold particles.Figure 4 Immunoelectron microscopy results of 1A6

2.6 1A6 針對的 TAP2 PBD 抗原表位的鑒定

將 TAP2 的 PBD 區(qū)域截短為相互重疊的3段分別表達，共截短 2 次。SDS-PAGE 結(jié)果表明，除 F81-V143以外，其余片段均成功表達(圖5A和5C)。Western blot 分析結(jié)果表明，1A6 只與A1-K66(圖5B)和N16-I41(圖5D)發(fā)生特異性反應(yīng)，其余表達產(chǎn)物均無特異性顯色條帶。

2.7 表位序列分析

將 2.6 獲得的 1A6 所針對鴨 TAP2 表位序列與 NCBI 登錄的其他禽類進行 Blast 分析，結(jié)果表明，該表位與所有登錄的鴨(Anasplatyrhynchos)序列同源性介于100%(AAQ62605.1)-92% (AAZ30019.1) 之間，與家鵝(Ansercygnoidesdomesticus)和山齒鶉(Colinusvirginianus)的同源性分別為 96% 和 77%，與日本鵪鶉(Coturnixjaponica)、火雞(Meleagrisgallopavo)、紅腹錦雞(Chrysolophuspictus)、黑琴雞(Lyrurustetrix)、金雕加拿大亞種(Aquilachrysaetoscanadensis)、帝企鵝(Aptenodytesforsteri)以及所有 MHC-B 單倍型雞[B2(BAG69301.1)、B5(BAG 69315.1)、B6(BAG 69329.1)、B9(BAG69357.1)、B13(BAG 69399.1)、B14(AEE25622.1)、B15(BAG 69412.1)、B17(BAG 69426.1)、B19(BAG 69440.1)、B23(BAG 69466.1)、B24(BAG 69480.1)]和不同品系的來航雞的序列同源性均為69%，與杜洛克豬(Susscrofa， XP_020954031.1)的同源性為 53%。進化樹見圖6。

另外，通過 Mega.alin 分析軟件，將表位序列與 HBW-B1、B3 和 B4 鴨的同源序列比對，結(jié)果氨基酸同源性分別為 97.0%、97.2%、96%。

注：箭頭表示特異性反應(yīng)位置。圖5 1A6表位鑒定的Western blot結(jié)果Note. Arrows indicate specific reaction.Figure 5 Results of epitope identification of 1A6

注：箭頭表示1A6表位識別的氨基酸序列圖6 1A6識別的表位序列不同禽類種屬間的進化樹Note. Arrow indicates the antigenic epitope against 1A6.Figure 6 Distance tree of the epitope among various poultries

3 討論

隨著近年來國家對實驗動物學科建設(shè)和行業(yè)發(fā)展的不斷重視，我國實驗動物種質(zhì)資源得到迅猛發(fā)展，樹鼩、長爪沙鼠、多種魚類和鴨等動物品種品系實現(xiàn)了標準化。在這些新型實驗動物資源逐步向生命科學領(lǐng)域深入服務(wù)支撐的過程中，一個有別于傳統(tǒng)實驗動物資源的瓶頸問題愈加凸顯，即缺乏新資源所特異性的重要免疫學分子的檢測試劑。SPF級鴨的研究面臨同樣的問題。

目前我們已經(jīng)培育成功以紹興麻鴨為基礎(chǔ)的MHC單倍型HBW/B1、HBW/B2、HBW/B3和 HBW/B4等4個SPF鴨品系，以金定麻鴨為基礎(chǔ)的4個封閉群家系，全部飼養(yǎng)于屏障環(huán)境或隔離環(huán)境。隨著T/CALAS 18-2017 “實驗動物SPF鴨微生物學監(jiān)測總則”等實驗鴨病原學、遺傳學、配合飼料、飼養(yǎng)管理等質(zhì)量相關(guān)的中國實驗動物學會團體標準的實施，在中國實驗動物信息網(wǎng)數(shù)據(jù)庫發(fā)布的實驗鴨生物學特性數(shù)據(jù)越來越豐富，SPF鴨的應(yīng)用也越來越廣泛。截止2017年底，已面向全國提供了7.3萬枚鴨胚、1.2萬羽雛鴨和2.3萬毫升鴨血，取得了良好的社會效益和經(jīng)濟效益。然而，由于商品化的鴨免疫學檢測試劑的缺乏，使利用SPF鴨開展的禽病分子機制研究局限在非常窄的范圍。例如，已知TAP蛋白負責將病毒感染細胞或腫瘤細胞內(nèi)的內(nèi)源性抗原肽轉(zhuǎn)運給經(jīng)典MHC I類分子復合物，多種哺乳動物皰疹病毒通過抑制或阻礙TAP路徑實現(xiàn)免疫逃避[16-17]，而鴨皰疹病毒尚無這方面的報道，缺乏特異性的檢測試劑無疑是瓶頸之一。

TAP蛋白在進化過程中具有保守性，人、豬、牛以及小鼠的氨基酸同源性達到70%～80%[18]。本課題組前期利用商品化的人TAP和小鼠TAP試劑盒檢測對鴨TAP蛋白的反應(yīng)性，結(jié)果不能滿足實驗要求。本研究利用鴨TAP蛋白的肽結(jié)合區(qū)保守區(qū)域作為免疫原，獲得單抗1A6。免疫印跡結(jié)果表明單抗針對的抗原表位序列同源性自高向低依次為家鵝(96%)、雞(69%)、日本鵪鶉(69%)和豬(53%)，實驗檢測結(jié)果表明1A6只對SPF雞有IFA和免疫組化反應(yīng)性，對鵝、豬和鵪鶉的腸組織均為陰性。鵝和雞的表位同源性分析與實驗檢測結(jié)果不符，可能是因為提供序列數(shù)據(jù)或檢測的動物的個體遺傳差異造成的。

為了確證1A6的特異性，本研究利用受到免疫應(yīng)答刺激的鴨組織(鴨瘟疫苗免疫后再攻擊強毒)，選取腸道黏膜進行了免疫電鏡檢測，結(jié)果在細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上觀察到明顯的金顆粒，與TAP蛋白主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表達和發(fā)揮功能相符合，而且受刺激的鴨組織細胞內(nèi)金顆粒數(shù)量比未受刺激的正常鴨分布更多，也說明TAP蛋白的表達量受到上調(diào)。本研究在細胞核的核膜內(nèi)和核內(nèi)核孔處檢測到了TAP蛋白，這在現(xiàn)有的文獻中尚未見報道，究竟有何生物學意義值得深入探究。