盧克剛，張紅霞

（1.山東職業(yè)學(xué)院，山東濟(jì)南250104；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

角鯊烯（squalene）是由6 個(gè)異戊二烯單位構(gòu)成的鏈狀三萜化合物，含6 個(gè)全反式雙鍵，分子式為C30H50，化學(xué)名為2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。成品角鯊烯為微黃色至無(wú)色透明油狀液體，略帶特有的芳香氣味，易溶于乙醚、石油醚、丙酮和四氯化碳，微溶于醇和冰醋酸，不溶于水[1]。角鯊烯具有抗氧化[2]、抗輻射[3]、攜氧[4]、解毒[5]、調(diào)節(jié)膽固醇代謝[6]等良好的生物活性，應(yīng)用于化妝品、保健食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

角鯊烯分布廣泛，不僅存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，在微生物體內(nèi)亦有發(fā)現(xiàn)。深海鯊魚(yú)肝油中角鯊烯含量一般都在40 g/100 g 以上，被認(rèn)為是早期角鯊烯的主要來(lái)源[7]。動(dòng)物來(lái)源的角鯊烯需要大量捕殺以鯊魚(yú)為主的深海魚(yú)類(lèi)，隨著生態(tài)保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，使鯊魚(yú)肝油來(lái)源的角鯊烯越來(lái)越少。利用微生物代謝調(diào)控發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯，目前產(chǎn)量較低，存在生產(chǎn)用菌株、工程菌株獲得較難等諸多技術(shù)難題，還無(wú)法達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平。自1935年Thorbjarnarson T 等[8]首次在橄欖油中發(fā)現(xiàn)角鯊烯開(kāi)始，人們逐漸重視植物來(lái)源的角鯊烯的研究與開(kāi)發(fā)，研究發(fā)現(xiàn)莧菜籽油、羅漢果種仁油、米糠油、棕櫚油等農(nóng)作物種子油及植物油脫臭餾出物（deodorizer distillate，DD）中均有角鯊烯，而含量較高的橄欖油和莧菜籽油更是成為制備角鯊烯的重要工業(yè)原料[9]，因此，開(kāi)發(fā)植物資源的角鯊烯，將是解決角鯊烯來(lái)源的有效途徑。本文擬對(duì)近期植物來(lái)源角鯊烯制備方法和檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為角鯊烯的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 植物來(lái)源角鯊烯的制備方法

角鯊烯的制備方法可分為兩類(lèi)，一類(lèi)是直接從生物材料中提取、純化，另一類(lèi)是利用化學(xué)或生物技術(shù)手段合成。目前，植物來(lái)源的角鯊烯主要是直接從植物油、植物油脫臭餾出物及其他材料提取純化而得。由于油脂價(jià)格昂貴，直接利用植物油制備角鯊烯成本較高；植物油脫臭餾出物是植物油脂精煉過(guò)程中的副產(chǎn)物，角鯊烯也富集于其中，因此是制備角鯊烯的理想原料，其中橄欖油脫臭餾出物中的角鯊烯已實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)；其它如羅漢果種仁、茶籽仁、莧菜種子、省沽油種子、尾巨桉木材等也發(fā)現(xiàn)含有一定量的角鯊烯。

由于共存成分復(fù)雜、極性相近、含量較低、綜合利用等原因，一般植物來(lái)源角鯊烯的制備過(guò)程中要采用多種方法組合。常見(jiàn)的方法有溶劑提取、皂化、酯化、分子蒸餾、超臨界萃取、柱色譜等[10]，每種方法都有其特點(diǎn)。幾種植物來(lái)源角鯊烯制備方法[11-37]見(jiàn)表1。角鯊烯易溶于石油醚、三氯甲烷等溶劑，可利用索氏抽提與其他雜質(zhì)分離；角鯊烯具有不可皂化性，像甘油三酯含量較高的原料可經(jīng)皂化后，再用有機(jī)溶劑萃取而制得角鯊烯；游離脂肪酸、中性油含量較高的脫臭餾出物通常先用甲醇進(jìn)行酯化處理，轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯，再結(jié)合分子蒸餾法進(jìn)行分離純化；以二氧化碳為溶劑的超臨界萃取對(duì)角鯊烯有較強(qiáng)的提純能力；柱色譜法有較好的選擇性，一般用硅膠作為固定相，非極性的角鯊烯不易被吸附首先流出，其他極性較大的物質(zhì)易被吸附而有效分離，要得到高純度角鯊烯大多都采用了柱色譜工藝；其它利用銀離子絡(luò)合[35]、環(huán)糊精包合[36]等法也可以對(duì)角鯊烯進(jìn)行有效分離。

表1 幾種植物來(lái)源角鯊烯的制備方法Table 1 Preparation methods of squalene from several plants

2 植物來(lái)源角鯊烯的檢測(cè)方法

美國(guó)官定分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）標(biāo)準(zhǔn)（Revised 1996）中采用滴定法測(cè)定角鯊烯的含量[38]，該方法檢測(cè)過(guò)程比較繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且誤差較大。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的植物來(lái)源角鯊烯的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）、液相色譜法（liquid chromatography，LC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）。液相色譜法包括高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）。在定量方式方面，氣相色譜法和液相色譜法大多采用外標(biāo)法，而內(nèi)標(biāo)法應(yīng)用較少；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法則主要采用內(nèi)標(biāo)法定量。

在檢測(cè)角鯊烯過(guò)程中，根據(jù)不同樣品的特點(diǎn)選用適宜的預(yù)處理方法，常見(jiàn)的有溶劑稀釋、皂化后萃取、凝膠色譜凈化、固相萃取、索氏提取器抽提、甲酯化后萃取等方法。雜質(zhì)干擾較少的樣品可采用溶劑稀釋后直接進(jìn)樣。對(duì)于富含脂類(lèi)和色素等干擾較多的樣品，則進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方可進(jìn)行儀器分析，否則干擾物會(huì)影響色譜柱的分離效果，嚴(yán)重時(shí)可造成整個(gè)色譜系統(tǒng)的污染。糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LST 6120-2017《糧油檢驗(yàn)植物油中角鯊烯的測(cè)定氣相色譜法》就是利用角鯊烯的不皂化性，植物油樣品先經(jīng)氫氧化鉀-乙醇溶液皂化，再經(jīng)正己烷萃取，以角鯊?fù)闉閮?nèi)標(biāo)測(cè)定角鯊烯的含量[39]。

2.1 氣相色譜法

影響氣相色譜法檢測(cè)的主要因素有毛細(xì)管柱、柱溫、載氣流速和檢測(cè)器等。由于角鯊烯具有高沸點(diǎn)（285 ℃）、難揮發(fā)等特點(diǎn)，為保證其充分氣化，所以選取非極性的高溫低流失毛細(xì)管柱，文獻(xiàn)中多選HP-5毛細(xì)管色譜柱（30.0 m×0.32 mm×0.25 μm）。柱溫的控制主要有恒溫、程序升溫兩種方式，由于植物來(lái)源的樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，通常采用程序升溫方式，以實(shí)現(xiàn)角鯊烯與樣品中其他組分有效分離。氣相色譜法常用的氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）對(duì)碳?xì)浠衔镉休^高靈敏度，角鯊烯是由碳和氫兩種元素組成，文獻(xiàn)報(bào)道中都選用FID 檢測(cè)器。幾種植物來(lái)源角鯊烯的氣相色譜法檢測(cè)方法[40-46]見(jiàn)表2。

表2 幾種植物來(lái)源角鯊烯氣相色譜檢測(cè)方法Table 2 Determination of squalene in plants by GC

續(xù)表2 幾種植物來(lái)源角鯊烯氣相色譜檢測(cè)方法Continue table 2 Determination of squalene in plants by GC

2.2 液相色譜法

色譜柱、流動(dòng)相體系、洗脫模式和檢測(cè)器的選擇是影響液相色譜法的主要因素。由于角鯊烯是非極性化合物，故以表面鍵合極性相對(duì)較弱的十八碳烷烴的反相C18柱比較適合角鯊烯的測(cè)定，而一般不選擇正相色譜柱。根據(jù)樣品中各化合物的極性大小差異，植物來(lái)源角鯊烯檢測(cè)時(shí)使用的流動(dòng)相體系主要有一元、二元體系，并且以二元體系為主。一元溶劑體系主要是甲醇，二元溶劑體系主要有甲醇/乙腈、乙腈/叔丁基甲醚、乙腈/四氫呋喃等組合。預(yù)處理后樣品組分相對(duì)簡(jiǎn)單，在洗脫模式方面多采用等度洗脫，而少數(shù)比較復(fù)雜的樣品則采用梯度洗脫。由于角鯊烯在紫外光區(qū)有吸收峰，目前檢測(cè)器絕大多數(shù)選擇的是紫外檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)范圍大多在203 nm～210 nm之間。幾種植物來(lái)源角鯊烯的高效液相色譜法檢測(cè)方法[47-56]見(jiàn)表3。

表3 幾種植物來(lái)源角鯊烯高效液相色譜檢測(cè)方法Table 3 Determination of squalene in plants by HPLC

續(xù)表3 幾種植物來(lái)源角鯊烯高效液相色譜檢測(cè)方法Continue table 3 Determination of squalene in plants by HPLC

由于超高效液相色譜（UPLC）使用的填料粒徑更小、死體積更小、工作壓力更高、線性速度更快，所以在靈敏度和分析速度等方面比HPLC 都有很大提高。陳偉珠等[57]使用超高壓液相色譜儀配TUV 檢測(cè)器，以甲醇-水（95∶5，體積比）、流速0.4 mL/min、波長(zhǎng)210 nm的條件下進(jìn)行檢測(cè)，角鯊烯在0.2 μg/mL～10 μg/mL 范圍內(nèi)濃度和面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.1 ng，平均回收率為100.82%，樣品的保留時(shí)間縮短，節(jié)約溶劑，提高了檢測(cè)效率。

2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

與氣相色譜法、液相色譜法相比，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有較高的靈敏度和選擇性。該法中氣相色譜條件的選擇與氣相色譜法一致，多采用弱極性HP-5MS 毛細(xì)管柱和程序升溫方式。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法最常用的離子化方式是電子轟擊離子化（EI）和化學(xué)離子化（CI）。EI 源適合絕大多數(shù)化合物的檢測(cè)；而CI源對(duì)高親電化合物的靈敏度高、選擇性強(qiáng)，對(duì)某些帶有強(qiáng)電負(fù)性（如含有Cl、F、O、Br 等）的化合物檢測(cè)時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)越性。角鯊烯不具有電負(fù)性，所以測(cè)定角鯊烯最常用的是EI 源。質(zhì)譜質(zhì)量分析器有四極桿和離子阱，其掃描模式主要采用選擇離子掃描（SIM）和全掃描（Scan）兩種，其中SIM 掃描選定離子結(jié)構(gòu)信息，常用于微量或痕量組分的定量分析，而Scan 掃描所有未知物結(jié)構(gòu)信息，測(cè)量較為全面，主要用于組分的定性分析。幾種植物來(lái)源角鯊烯氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)方法[58-65]見(jiàn)表4。

表4 幾種植物來(lái)源角鯊烯氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法Table 4 Determination of squalene in plants by GC-MS

續(xù)表4 幾種植物來(lái)源角鯊烯氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法Continue table 4 Determination of squalene in plants by GC-MS

3 結(jié)語(yǔ)

角鯊烯具有多種生物活性，應(yīng)用于多個(gè)不同領(lǐng)域。因其能夠抗氧化、抗紫外線、保濕、營(yíng)養(yǎng)肌膚而在化妝品中用作潤(rùn)膚劑、保濕劑[9]，還可作為功能性食品添加劑、藥物緩釋劑、食品機(jī)械設(shè)備的潤(rùn)滑劑、衣物護(hù)理劑等使用[1]。隨著人們對(duì)角鯊烯認(rèn)識(shí)的不斷深入，對(duì)其需求會(huì)不斷加大。以上綜述可見(jiàn)角鯊烯的植物來(lái)源比較廣泛，相比較動(dòng)物來(lái)源和微生物發(fā)酵更具有可持續(xù)性，會(huì)成為解決角鯊烯來(lái)源的一條重要途徑。但由于角鯊烯在大多數(shù)植物體中含量較低，導(dǎo)致單一提取制備成本較高，應(yīng)探索綜合開(kāi)發(fā)利用。因此，在角鯊烯的研究開(kāi)發(fā)過(guò)程中，要不斷優(yōu)化制備工藝，多采用先進(jìn)提取分離技術(shù)，降低能耗，減少有毒有害溶劑的使用，開(kāi)發(fā)出更加高效、環(huán)保、可行的方法。目前的檢測(cè)方法對(duì)前處理要求高、過(guò)程復(fù)雜，所用大型儀器價(jià)格昂貴，不能大量普及。因而應(yīng)研究開(kāi)發(fā)更高效、穩(wěn)定、便捷的基質(zhì)前處理方法，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)有效凈化，提高檢測(cè)效率。