趙彩嬌，盧美靜，蔣云芳，黃逸珠

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

隨著人類生活水平的不斷提高，如何延緩衰老，保持青春成為大眾關(guān)注的話題之一。目前有關(guān)衰老機(jī)制的研究[1]有很多：免疫學(xué)說、細(xì)胞凋亡學(xué)說、自由基學(xué)說、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)說等。譚成富等[2]從細(xì)胞凋亡學(xué)說方面入手，觀察針灸對(duì)MIRI大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示,電針或艾灸“內(nèi)關(guān)”穴抑制了細(xì)胞凋亡,對(duì)MIRI大鼠心肌具有保護(hù)作用。李艷梅等[3]從自由基學(xué)說方面入手，研究不同時(shí)辰溫針灸足三里、關(guān)元對(duì)老年人延緩衰老的影響，結(jié)果表明治療組SOD含量比治療前顯著提升，針灸對(duì)于SOD含量具有促進(jìn)作用。

該項(xiàng)目主要從免疫學(xué)說方面入手研究。免疫學(xué)說認(rèn)為[4]：隨著人年齡的增長，人體免疫功能隨之減弱，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答水平下降，以致不能及時(shí)抵御外邪，增加機(jī)體的患病機(jī)率。目前發(fā)現(xiàn)[5]靈龜八法按時(shí)開穴灸具有提高機(jī)體的免疫功能、延緩機(jī)體衰老進(jìn)程的功效。然而，現(xiàn)階段對(duì)靈龜八法關(guān)于免疫學(xué)說基因表達(dá)延緩衰老方面的研究甚少。為進(jìn)一步探究，此項(xiàng)目以衰老模型大鼠為研究對(duì)象，觀察靈龜八法對(duì)衰老模型大鼠脾臟組織IL-10、IFN-γ活性及IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA基因表達(dá)的影響,探討靈龜八法在免疫學(xué)說方面，延緩衰老的效果。進(jìn)一步為靈龜八法按時(shí)開穴灸的作用機(jī)理，提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠48只，日齡40～50天，體質(zhì)量200～250 g，動(dòng)物由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為:SCXK(湘)2016-0002。實(shí)驗(yàn)前，將實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)室要求每天光照與黑暗各12 h(光照時(shí)間為7:00—19:00),室溫20～23℃，在此期間予以大鼠自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合國家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》要求[6]，實(shí)驗(yàn)全過程嚴(yán)格遵循“3R”原則。

1.2 藥品及試劑

D-半乳糖(Sigma公司)；DP431RNApreppur 動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(北京天根公司)；FP209 Talent 熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green，北京天根公司)；KR108 FastQuant RT Super Mix(北京天根公司)；大鼠細(xì)胞調(diào)節(jié)因子(IL-10、IFN-γ)ELISA 試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；艾絨(南陽綠瑩艾草生物制品有限公司)。

1.3 儀器

Centrifuge 5810R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；BCD-210DCM冰箱(青島海爾股份有限公司)；MDF-H73865醫(yī)用低溫箱(-80℃，日本三洋電機(jī)株式會(huì)社)；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海鴻都電子科技有限公司)；SW-CJ-IFD潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；FA2204B電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模方法

采用秦氏造模方法[7]按500 mg/kg·d把D-半乳糖用0.9%的生理鹽水配置成 10%的D-半乳糖溶液。除空白組外，其余組大鼠于每日進(jìn)行腹腔注射D-半乳糖溶液，1次/天，連續(xù)60天。連續(xù)造模60天后，大鼠出現(xiàn)毛色枯黃無光澤、毛發(fā)易脫落、精神萎靡、行動(dòng)遲緩、畏寒怕冷、四肢冰涼、小便增多等衰老癥狀。

2.2 處理方法

采用完全隨機(jī)分組法，查隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為 A組(空白組)、B組(模型組)、C組(脾俞加腎俞治療組)、D組(靈龜八法治療組)，每組12只。各組處理方法如下：

A 組:自由進(jìn)食，每日稱重，不造模，不治療。

B組：每日稱重，每日進(jìn)行腹腔注射10%的D-半乳糖溶液，連續(xù)給藥60天。造模結(jié)束后常規(guī)飼養(yǎng)30天，不予以治療。

C組:每日稱重，每日進(jìn)行腹腔注射10%的D-半乳糖溶液，連續(xù)給藥60天。造模結(jié)束后，在大鼠脾俞、腎俞穴進(jìn)行艾炷灸治療。施灸方法:根據(jù)《豚鼠針灸穴位圖譜的研制》[8]大鼠穴位定位取穴，先將施灸部位脾俞穴和腎俞穴的體毛剪去，再涂以少量蘆薈膠以固定艾炷，無癍痕灸，灸至以大鼠全身掙扎為度，每次連續(xù)3壯，1次/天 ，共30天。

D組:每日稱重，每日進(jìn)行腹腔注射10%的D-半乳糖溶液，連續(xù)給藥60天。造模結(jié)束后，每日在大鼠靈龜八法所開穴位處，進(jìn)行艾炷灸治療。開穴方法：按照謝氏“靈龜八法開穴簡表”[9]進(jìn)行,選取當(dāng)日實(shí)驗(yàn)治療的時(shí)辰進(jìn)行開穴。施灸方法:根據(jù)《豚鼠針灸穴位圖譜的研制》[8]大鼠穴位定位取穴，先將施灸的開穴部位的體毛剪去，再涂以少量蘆薈汁以固定艾炷，無瘢痕灸，每灸至以大鼠全身掙扎為度，每次連續(xù)3壯，1次/天，共30天。

2.3 樣本采集

各組大鼠于實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日取血后處死，于冰臺(tái)上快速取脾臟組織，切碎組織，加入冰0.9%的生理鹽水,用手動(dòng)勻漿器制成10%的脾勻漿,4℃3 000 r/min,離心10 min,提取上清。另取200 mg脾臟組織，浸泡在RNA保存液中，放入-70℃冰箱貯存待檢。

2.4 檢測方法

2.4.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa) 用大鼠細(xì)胞調(diào)節(jié)因子IL-10、IFN-γ試劑盒檢測脾臟組織中IL-10、IFN-γ含量。

2.4.2 基因表達(dá)檢測 實(shí)時(shí)熒光絕對(duì)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測大鼠脾臟IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA基因表達(dá)量。以cNDA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR分析：每個(gè)PCR反應(yīng)體系內(nèi)容如下：2×Talent qPCRPreMix 12.5 μL，上、下游引物各0.75 μL，cDNAΜl，ddH2O 11 μL。采用相對(duì)定量ΔΔCT法，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸32 s，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析以驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。反應(yīng)結(jié)束獲得IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA的循環(huán)閾值(cycle threshold ,Ct)，采用 △△Ct( △△Ct=△Ct-△Ct基礎(chǔ)值，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參)方法分析,根據(jù)2-△△Ct公式計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。見表1。

表1 IL-10、IFN-γ引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠脾臟組織中IL-10、IFN-γ含量情況

D組IL-10含量明顯高于B組(P<0.05)，與A組相比下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;D組與C組相比較(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D組IFN-γ明顯低于B組(P<0.05)，與A組相比上升(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;D組與C組相比較(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明靈龜八法開穴灸有效地減少了衰老模型大鼠IFN-γ的含量，減輕了致炎因子在衰老模型中介導(dǎo)的炎癥刺激,同時(shí)增加了大鼠IL-10的數(shù)目，降低機(jī)體局部炎性細(xì)胞因子的活性，有效地緩解了機(jī)體衰老。見表2。

表2 各組大鼠脾臟組織中IL-10、IFN-γ含量比較

注：與B組比較,1)P<0.05；與A組比較,2)P<0.05；與C組比較,3)P>0.05。

3.2 各組大鼠脾臟組織中IFN-γ mRNA基因表達(dá)量情況

D組IFN-γ mRNA明顯低于B組(P<0.05),與A組相比上升(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;D組與C組相比較(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明靈龜八法開穴灸有效減少衰老模型大鼠促炎因子IFN-γ mRNA基因數(shù)目的生成，減輕了亞急性衰老模型大鼠機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，有效緩解衰老。見圖1。

3.3 各組大鼠脾臟組織中IL-10 mRNA基因表達(dá)量情況

D組IL-10 mRNA明顯高于B組(P<0.05),與A組相比，顯著下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;D組與C組相比較(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示靈龜八法開穴灸增加了衰老大鼠抗炎因子IL-10 mRNA的基因數(shù)目，對(duì)D-半乳糖引起的亞急性炎癥反應(yīng)起到了一定的保護(hù)作用。見圖1。

注:與B組比較,●P<0.05 ；與A組比較,■P<0.05；與C組比較,□P>0.05。圖1 各組大鼠脾臟組織中IFN-γ mRNA、IL-10 mRNA基因表達(dá)量

4 討論

近年，醫(yī)學(xué)界對(duì)靈龜八法延緩衰老進(jìn)行了研究：陳棟[10]研究靈龜八法開穴灸對(duì)陽虛模型大鼠血清免疫球蛋白的影響，實(shí)驗(yàn)表明提高了陽虛模型大鼠免疫球蛋白濃度水平。毛楠[11]探討靈龜八法抗衰老的機(jī)理,結(jié)果顯示靈龜八法對(duì)老年脾虛患者SOD的含量具有調(diào)整作用，達(dá)到了延緩衰老的目的。

靈龜八法是時(shí)間針灸學(xué)的重要組成部分，以時(shí)間概念為先決因素，是體現(xiàn)“因時(shí)制宜”的一種治療方法[12]。靈龜八法把天時(shí)的變化特點(diǎn)與人體奇經(jīng)八脈氣血開闔盛衰的特點(diǎn)相結(jié)合，選取八脈交會(huì)穴進(jìn)行治療。調(diào)整了人體內(nèi)奇經(jīng)八脈氣血運(yùn)行，進(jìn)一步疏通十二經(jīng)絡(luò)，調(diào)節(jié)十二經(jīng)脈的氣血盛衰，達(dá)到防病治病、延緩衰老的目的。本研究結(jié)果表明,靈龜八法有效地調(diào)整了衰老模型大鼠脾臟組織中IL-10、IFN-γ活性及IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA基因表達(dá)，有效地減少了致炎因子的生成，增加了抗炎因子數(shù)量。

衰老引起的最明顯的現(xiàn)象是免疫系統(tǒng)的失調(diào)，包括免疫衰退和慢性炎癥兩方面[13]。免疫系統(tǒng)功能衰退減弱了機(jī)體的免疫保護(hù)作用，同時(shí)產(chǎn)生了慢性炎癥的反應(yīng)，增加了獲得自身免疫性疾病的機(jī)率[14]。本實(shí)驗(yàn)采用注射D-半乳糖制造亞急性衰老大鼠模型。D-半乳糖造?？稍跈C(jī)體內(nèi)引起亞急性的炎癥反應(yīng)[15]，使鼠體內(nèi)組織器官出現(xiàn)類似衰老的退行性變,發(fā)生免疫功能低下、生化改變、基因表達(dá)與調(diào)控異常等與自然衰老相似的癥狀。

IL-10是人體內(nèi)重要的抗炎因子，是Th2 細(xì)胞因子之一，它對(duì)D-半乳糖引起的亞急性炎癥反應(yīng)具有一定的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),IL-10是抗炎與免疫抑制性細(xì)胞因子[16]，可抑制多種炎性介質(zhì)釋放，減少促炎細(xì)胞因子分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、維持細(xì)胞因子平衡的作用。另外，IL-10通過 NF - κB 信號(hào)通路抑制促炎癥因子的合成與分泌，可下調(diào)炎癥反應(yīng)的瀑布效應(yīng)[17]。靈龜八法治療組IL-10活性及IL-10 mRNA基因表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.05)，與空白組相比下降(P<0.05)。靈龜八法按時(shí)開穴灸增強(qiáng)了大鼠IL-10的活性，增加了IL-10 mRNA基因的數(shù)目，降低了機(jī)體局部炎性細(xì)胞因子的活性反應(yīng)，減少了脾臟組織中局部中性粒細(xì)胞的浸潤、活化，從而減輕脾臟細(xì)胞的損害，起到了對(duì)脾臟細(xì)胞的保護(hù)作用。這可能是靈龜八法延緩衰老的免疫機(jī)制。

INF-γ是TH1細(xì)胞釋放的代表性的致炎因子之一,主要起免疫調(diào)節(jié)作用[18]。它能促進(jìn)T、B細(xì)胞分化，是一種強(qiáng)有力的吞噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的激活物。有研究表明,IFN-γ可誘發(fā)巨噬細(xì)胞的炎癥吞噬反應(yīng)[19]。當(dāng)發(fā)生感染時(shí)，維持著動(dòng)態(tài)平衡的二者會(huì)出現(xiàn)比例失調(diào)，從而引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)。另外，IFN-γ可激活體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)炎性細(xì)胞的合成與分泌，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放炎癥蛋白與炎癥介質(zhì)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠IFN-γ含量及IFN-γ mRNA基因表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.05)，與空白組相比上升。靈龜八法有效抑制了衰老模型大鼠IFN-γ的活性，減少了IFN-γ mRNA基因數(shù)目，抑制了大鼠脾臟組織的巨噬細(xì)胞活化，減少了巨噬細(xì)胞的大量侵襲，有效抑制D-半乳糖引起的炎癥反應(yīng)，并恢復(fù)了機(jī)體的抗炎平衡,這是其延緩衰老的一個(gè)重要方向。

總之，靈龜八法按時(shí)開穴灸有效地調(diào)整了衰老模型大鼠脾臟組織中IL-10、IFN-γ活性及IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA基因表達(dá)。減少了致炎因子的生成，增加了抗炎因子數(shù)量，減輕機(jī)體內(nèi)的炎性刺激，保護(hù)了脾臟組織，起到延緩衰老的作用，再一次證明了靈龜八法延緩衰老的機(jī)理與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)機(jī)制有密切聯(lián)系。