楊 寧 陳馳原 李國(guó)曉 王愛英 張榮標(biāo) 唐 健

(1.江蘇大學(xué)電氣信息工程學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013； 2.中國(guó)水稻研究所稻作技術(shù)研究與發(fā)展中心， 杭州 311401)

0 引言

作物真菌病害因其傳播速度快、危害大等特點(diǎn)給病害檢測(cè)預(yù)警帶來了巨大的挑戰(zhàn)[1-2]。真菌病害是由散布在空氣中的真菌孢子浸染水稻引起的[3-6]。因此，對(duì)空氣中孢子濃度的測(cè)定是病害流行分析和預(yù)警中不可或缺的部分[7]。

作物真菌病害的檢測(cè)方法歸結(jié)起來主要有免疫檢測(cè)法、核酸檢測(cè)法、微懸臂梁檢測(cè)法、分子生物學(xué)檢測(cè)法、形態(tài)學(xué)鑒定法等。免疫檢測(cè)法利用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，實(shí)現(xiàn)特定微生物濃度的快速檢測(cè)，精度較高[8]。核酸檢測(cè)法利用分子擴(kuò)增技術(shù)，大大減少了檢測(cè)時(shí)間，且靈敏度較高。上述方法需要特異性抗體或引物以及專業(yè)的人員及設(shè)備，實(shí)現(xiàn)野外即時(shí)檢測(cè)的難度較大[9]。微懸臂梁檢測(cè)法是一種將敏感材料或受體分子修飾在微懸臂梁表面，對(duì)待檢目標(biāo)氣體或液體分子進(jìn)行吸附，造成微懸臂梁運(yùn)動(dòng)狀態(tài)改變來標(biāo)定待檢物濃度的方法[10]。如NUGAEVA等[11]使用鍍金和未涂覆硅的微機(jī)械懸臂陣列，快速定量檢測(cè)了黑曲霉和釀酒酵母濃度。該方法具有高精度與高靈敏度的特點(diǎn)，但是微懸臂梁檢測(cè)法對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求嚴(yán)格，當(dāng)環(huán)境中的雜質(zhì)污染物被吸附時(shí)，將影響最終的檢測(cè)結(jié)果，難以適應(yīng)復(fù)雜的野外環(huán)境條件[12]。顯微圖像計(jì)數(shù)法由人工觀察顯微圖像并計(jì)算孢子數(shù)量，檢出限更低，檢測(cè)精度較高，克服了上述檢測(cè)方法的弊端，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、人力消耗大、數(shù)字化程度低[13]。而目前利用圖像形態(tài)學(xué)鑒定進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別真菌孢子個(gè)數(shù)的相關(guān)技術(shù)也逐步出現(xiàn)，李小龍等[14]、齊龍等[15]利用形態(tài)學(xué)鑒定方法對(duì)捕捉的孢子實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，但該檢測(cè)法主要依賴野外采樣和實(shí)驗(yàn)室觀測(cè)兩個(gè)步驟，滯后性較大，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)作物真菌病害的早期預(yù)警。

姜玉英等[16]、雷雨等[17]將自動(dòng)對(duì)焦顯微鏡集成到孢子捕捉儀上實(shí)現(xiàn)捕捉數(shù)量的大概計(jì)數(shù)，MELO等[18]利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)深度學(xué)習(xí)檢測(cè)方法對(duì)孢子進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，這些方法依舊需要借助高倍顯微鏡等昂貴的儀器進(jìn)行輔助檢測(cè)，相較于顯微圖像計(jì)數(shù)法，提升了數(shù)字化水平，但是技術(shù)復(fù)雜，成本仍然較高，無法推廣實(shí)施。國(guó)內(nèi)托普云農(nóng)研制的孢子捕捉儀處于國(guó)際領(lǐng)先地位，但它仍然是基于傳統(tǒng)顯微圖像檢測(cè)方法，使用氣泵直接抽取空氣到捕捉儀內(nèi)的顯微鏡下，搭載圖像采集卡的顯微鏡采集孢子圖像，然后傳輸?shù)缴衔粰C(jī)對(duì)孢子進(jìn)行識(shí)別，整個(gè)系統(tǒng)體積巨大、成本高昂，不適合大面積農(nóng)業(yè)推廣與野外布置。

衍射技術(shù)多應(yīng)用于血液檢測(cè)[19]、藻類檢測(cè)[20]和精子檢測(cè)[21]等生物醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。LI等[22]根據(jù)惠更斯-菲涅爾衍射原理設(shè)計(jì)了基于衍射指紋的癌細(xì)胞活性檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)體積較大，使用不便。因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)環(huán)境純凈，所以每個(gè)衍射環(huán)均表示細(xì)胞，而病害孢子在野外傳播時(shí)，空氣環(huán)境復(fù)雜，有的衍射環(huán)可能表示其他雜質(zhì)，所以不宜直接分析衍射環(huán)，需要重構(gòu)后再分析，以便于專家直接標(biāo)記孢子和評(píng)判裝置檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。拍攝細(xì)胞衍射圖像時(shí)，只需將細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在系統(tǒng)內(nèi)即可，而病害孢子在空氣中傳播，無法直接采樣放置到系統(tǒng)內(nèi)檢測(cè)，所以需要富集裝置。針對(duì)孢子檢測(cè)的特點(diǎn)，本文將孢子的富集與衍射重構(gòu)檢測(cè)相結(jié)合，減小裝置體積與質(zhì)量，設(shè)計(jì)一種定時(shí)完成富集、進(jìn)樣、拍攝、重構(gòu)和檢測(cè)等系列功能于一體的裝置。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選用稻瘟病孢子作為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)樣本于2018年10月在中國(guó)水稻研究所采集。為了模擬稻瘟病孢子在空氣中的傳播狀態(tài)，利用氣溶膠發(fā)生器將稻瘟病孢子制成氣溶膠粒子，均勻釋放在體積為1 L的容器中。將氣泵分別與容器和檢測(cè)裝置相連，這樣容器中混有稻瘟病孢子的氣體可被抽集至涂有凡士林的PDMS薄片上用于圖像采集，空氣中病害真菌孢子實(shí)際濃度C的計(jì)算公式為

(1)

式中N——一次實(shí)驗(yàn)中采集到的孢子個(gè)數(shù)

t——?dú)獗霉ぷ鲿r(shí)間,s

V——?dú)獗昧髁浚琇/s

使用的微型氣泵流量為0.02 L/s，開展10組采樣實(shí)驗(yàn)，并在顯微鏡下觀察每組采樣的孢子數(shù)，最后由式(1)得出樣本的平均濃度為100個(gè)/L，將此濃度視為標(biāo)準(zhǔn)單位濃度。為保證裝置中用于采樣的PDMS薄片可長(zhǎng)期使用，只需將本次檢測(cè)到的孢子數(shù)減去前一次檢測(cè)到的孢子數(shù)即為本次實(shí)驗(yàn)采集到的孢子數(shù)，無需每次更換。

1.2 衍射重構(gòu)技術(shù)理論

1.2.1衍射成像裝置工作原理

傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡成像技術(shù)是基于光穿過透明物質(zhì)時(shí)發(fā)生波長(zhǎng)(顏色)和振幅(亮度)變化來實(shí)現(xiàn)的，肉眼通過顯微鏡直接觀察微生物等的形態(tài)。LED發(fā)出的光通過微孔轉(zhuǎn)換成相干光，從而實(shí)現(xiàn)相干照明。如圖1所示，LED光源發(fā)出的光經(jīng)過其正下方的微孔后，產(chǎn)生部分相干光，部分相干光傳播l1距離后照射到樣本平面(PDMS薄片)上。樣本平面上樣本的支透光與樣本的散射光互相干涉并被其正下方相距l(xiāng)2的CMOS成像芯片拍攝下來，圖2為樣本的衍射全息圖。首先利用角譜理論對(duì)全息圖進(jìn)行相位信息恢復(fù)，并基于恢復(fù)后的孢子圖像研究其形態(tài)學(xué)特征。

圖1 裝置成像原理示意圖Fig.1 Diagram of equipment imaging principle 1.光源 2.微孔 3.部分相干光 4.樣本平面 5.CMOS成像芯片

圖2 衍射全息圖像Fig.2 Hologram image

1.2.2角譜重構(gòu)理論

在標(biāo)量衍射的亥姆霍茲方程理論中，角譜理論從頻域的角度準(zhǔn)確描述了光的衍射過程，將部分相干光場(chǎng)看作不同方向傳播的平面波分量，光傳播方向上任意一點(diǎn)的復(fù)振幅均被表示出來[23]。

振幅為U，波長(zhǎng)為λ，方向余弦為cosα、cosβ、cosγ的波矢?jìng)鞑サ钠矫娌◤?fù)振幅為

(2)

U(x,y,z)=Uexp(2πi(xfx+yfy+zfz))

(3)

式中x、y——全息圖像素坐標(biāo)

z——再現(xiàn)距離

α、β、γ——平面參考光波與空間的yoz平面、xoz平面、xoy平面的夾角

根據(jù)角譜理論，由角譜重構(gòu)法得到的原像光場(chǎng)U(xi,yi,zi)的復(fù)振幅分布為

U(xi,yi,zi)=F-1(F(R(x,y)I(x,y))GAS(fx,fy))

(4)

其中

(5)

其中

式中F、F-1——傅里葉變換和逆傅里葉變換

I(x,y)——全息圖的強(qiáng)度分布

R(x,y)——參考光波振幅分布

GAS(fx，fy)——衍射在頻域的傳遞函數(shù)

角譜重構(gòu)過程如圖3所示，其中圖3a是裝置采集的衍射全息圖，圖3b是計(jì)算機(jī)利用角譜法計(jì)算重構(gòu)后得到的原像，可以看出孢子的輪廓被清晰地重構(gòu)出來。

圖3 孢子重構(gòu)圖像Fig.3 Spore reconstruction images

1.3 稻瘟病孢子再現(xiàn)像的目標(biāo)識(shí)別

為了準(zhǔn)確地識(shí)別出再現(xiàn)像中稻瘟病孢子，使用數(shù)字圖像處理技術(shù)對(duì)圖像進(jìn)行濾波、閾值分割和特征提取等操作。

1.3.1中值濾波

圖4a為角譜重構(gòu)之后得到的再現(xiàn)像，其中椒鹽噪聲和脈沖噪聲較多，針對(duì)該類圖像，選擇中值濾波進(jìn)行降噪[24]。圖4b是中值濾波后圖像，選取3×3的窗口對(duì)重構(gòu)圖像進(jìn)行濾波，在降低噪聲的同時(shí)盡可能地減少了細(xì)節(jié)丟失。

圖4 中值濾波Fig.4 Median filtering

1.3.2閾值分割

由圖5a知，檢測(cè)目標(biāo)顏色與背景顏色相差較大，故可以采用閾值分割的方式將圖像分為背景區(qū)域和目標(biāo)區(qū)域。預(yù)備試驗(yàn)知孢子灰度主要分布在0～100之間，灰度較高部分均為背景。故本文采用枚舉法確定閾值，枚舉區(qū)間為0～100，步長(zhǎng)為0.5，閾值分割流程如圖6所示，每次閾值加0.5，當(dāng)閾值為76.5時(shí)，輪廓最為明顯，分割結(jié)果如圖5b所示。

圖5 閾值分割Fig.5 Threshold segmentation

圖6 閾值分割流程圖Fig.6 Flow chart of threshold segmentation

圖8 圖像采集與光源模塊結(jié)構(gòu)Fig.8 Image acquisition and light source module 1.LED光源 2.微孔 3.部分相干光 4.樣本 5.PDMS薄片 6.CMOS模塊

1.3.3基于形狀特征的識(shí)別與計(jì)數(shù)算法

稻瘟病孢子具有獨(dú)特的形態(tài)特征(細(xì)長(zhǎng)的梨形)和較為固定的尺寸范圍(長(zhǎng)(15±5)μm，寬(7±2)μm)。因此，可以對(duì)重構(gòu)后的稻瘟病孢子選擇面積(Area)、細(xì)度(Thinness ratio)兩個(gè)形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行稻瘟病孢子的識(shí)別和計(jì)數(shù)。其中面積A定義為目標(biāo)區(qū)域所包含的像素?cái)?shù)量，用于描述區(qū)域面積。細(xì)度T用于描述目標(biāo)形狀的纖細(xì)程度，定義為

(6)

式中P——稻瘟病孢子的周長(zhǎng)

測(cè)定50組共500個(gè)稻瘟病孢子重建后圖像的面積A和細(xì)度T，其中一組數(shù)據(jù)如圖7所示，矩形方框內(nèi)為稻瘟病孢子。故將同時(shí)滿足A為10～30，且T為0.9～1.4的目標(biāo)判定為稻瘟病孢子。

圖7 面積-細(xì)度特征二維圖Fig.7 Two-dimensional chart of area-thinness characteristic

1.4 真菌病害微型檢測(cè)裝置設(shè)計(jì)

1.4.1圖像采集與光源模塊設(shè)計(jì)

利用CMOS圖像傳感器采集衍射全息圖，結(jié)果如圖8a所示。選擇Aptina公司500萬像素的MT9P031型圖像傳感芯片，成像區(qū)域尺寸為5.70 mm×4.28 mm。由于LED光源是單色光，故定制了該芯片的黑白版來直接獲得灰度圖像，以提升圖像的信噪比。

光源模塊(圖8b)長(zhǎng)度為4 cm(對(duì)應(yīng)圖1的l1)，其內(nèi)部光路和部件位置如圖8c所示，微孔直徑設(shè)定為100 μm，選擇OSRAM公司的LA E65B型(LED波長(zhǎng)617 nm)，兩部件位于光源模塊正上方，從上往下發(fā)出部分相干光覆蓋CMOS模塊的感光區(qū)域；訂制的PDMS薄片厚度為1 mm(對(duì)應(yīng)圖1的l2)，此設(shè)計(jì)可以簡(jiǎn)化光學(xué)設(shè)計(jì)，無需使用其他聚焦或校準(zhǔn)透鏡就可以照亮CMOS圖像傳感器的全部視場(chǎng)[25]。

1.4.2真菌病害微型檢測(cè)裝置設(shè)計(jì)

檢測(cè)裝置如圖9所示，采用鋰電池供電。實(shí)驗(yàn)時(shí)，計(jì)算機(jī)通過WiFi與圖像采集模塊通訊，并分析處理圖像數(shù)據(jù)。為了滿足氣傳孢子富集進(jìn)樣和裝置內(nèi)部避光的要求，設(shè)計(jì)了如圖10所示的迂回式氣路結(jié)構(gòu)。氣體從裝置上方入口進(jìn)入，沿著氣道從裝置兩側(cè)排出。

圖9 真菌病害微型檢測(cè)裝置示意圖Fig.9 Sketch of micro detection device for fungal disease 1.光源 2.PDMS薄片 3.氣泵 4.導(dǎo)管 5.孢子 6.出氣口 7.CMOS模塊

圖10 真菌病害微型檢測(cè)裝置氣路結(jié)構(gòu)示意圖Fig.10 Pneumatic schematic of miniature detection device for fungal diseases

在實(shí)驗(yàn)室中(溫度為(24±2)℃，相對(duì)濕度為(55±5)%，微塵數(shù)量在1 000個(gè)/m3以內(nèi))進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。首先打開氣泵將混有孢子的氣體吹集到涂有凡士林的PDMS薄片上。富集完成后，開啟LED光源和CMOS芯片對(duì)PDMS薄片上的樣本進(jìn)行拍照獲取衍射全息圖，并將圖像傳至計(jì)算機(jī)分析處理。裝置初步實(shí)現(xiàn)對(duì)病害真菌孢子進(jìn)行定時(shí)富集、進(jìn)樣、拍攝，以及對(duì)圖像進(jìn)行重構(gòu)和檢測(cè)等操作。

2 結(jié)果與分析

為了評(píng)價(jià)本文裝置的準(zhǔn)確性，以及其他環(huán)境雜質(zhì)等干擾物對(duì)稻瘟病孢子檢測(cè)的影響，用稻瘟病孢子(中國(guó)水稻研究所提供)、雜質(zhì)(主要包括微顆粒、菌絲等物質(zhì))進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn),將本裝置的計(jì)數(shù)結(jié)果與人工計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較。

圖11表明了PDMS薄片重復(fù)使用時(shí)的孢子檢測(cè)準(zhǔn)確率變化情況，當(dāng)孢子累計(jì)數(shù)量分別在2 500個(gè)和3 000個(gè)左右時(shí)，準(zhǔn)確率約為94%和90%，超過3 000個(gè)時(shí)，孢子重疊率較高，準(zhǔn)確率明顯下降。據(jù)文獻(xiàn)[26]可知，一季水稻成長(zhǎng)期為110 d左右，其中有大約一半的時(shí)間孢子濃度為0，剩下的一半時(shí)間中，約70%的時(shí)間內(nèi)孢子濃度不到100個(gè)/m3,少數(shù)幾天孢子濃度超過500個(gè)/m3。該裝置每天工作2 h(孢子捕捉儀在凌晨孢子萌發(fā)時(shí)開啟[27])，通常情況下，在孢子濃度為100個(gè)/m3時(shí)，裝置使用110 d(一季水稻成長(zhǎng)期)時(shí)，收集的孢子不到2 000個(gè)，故本裝置無需更換PDMS薄片即可滿足一季水稻監(jiān)控預(yù)警需求。圖12是一組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中稻瘟病孢子輪廓用紅色線條和數(shù)字標(biāo)記,圖12b是對(duì)圖12a矩形框內(nèi)圖像的局部放大。稻瘟病孢子顯微人工計(jì)數(shù)結(jié)果和自動(dòng)計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示，誤差(|N-M|/M×100%)最大不超過10%，平均誤差5.91%，均屬于可接受范圍。圖13是對(duì)兩種方法進(jìn)行Bland-Altman分析的結(jié)果，所有點(diǎn)均在95%一致性區(qū)間以內(nèi)，一致性較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于衍射重構(gòu)技術(shù)的作物真菌病害微型檢測(cè)裝置可以檢測(cè)并識(shí)別稻瘟病孢子，其自動(dòng)計(jì)數(shù)結(jié)果與人工計(jì)數(shù)結(jié)果高度線性相關(guān)(決定系數(shù)R2為0.99)，平均誤差為5.91%，在實(shí)驗(yàn)室條件下具有較好的準(zhǔn)確性。

圖11 薄片重復(fù)使用時(shí)孢子檢測(cè)準(zhǔn)確率Fig.11 Detection accuracy of repeated PDMS using

圖12 裝置檢測(cè)結(jié)果Fig.12 Diagram of equipment test result

表1 人工計(jì)數(shù)與裝置自動(dòng)計(jì)數(shù)結(jié)果Tab.1 Manual counting and device automatic counting results

圖13 Bland-Altman方法分析Fig.13 Analysis by Bland-Altman method

3 結(jié)束語

提出了一種基于衍射重構(gòu)技術(shù)的作物真菌病害孢子檢測(cè)方法，依據(jù)惠更斯-菲涅爾原理設(shè)計(jì)了作物真菌病害孢子微型檢測(cè)裝置。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)裝置的檢測(cè)結(jié)果和人工計(jì)數(shù)結(jié)果高度線性相關(guān),決定系數(shù)為0.99，平均誤差為5.91%，具有較好的準(zhǔn)確性。裝置體積為4 cm×4 cm×5 cm，且在實(shí)驗(yàn)室條件下測(cè)試可實(shí)現(xiàn)定時(shí)富集、進(jìn)樣、拍攝、重構(gòu)和檢測(cè)功能，為微型低成本作物真菌病害早期預(yù)警系統(tǒng)的研發(fā)提供了解決方案。