寇麗莎，齊永紅，張 璇，申少斐，王德富，牛顏冰

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西省果業(yè)工作站,太原 030001)

油用牡丹籽油含豐富的不飽和脂肪酸，有非常重要的保健及藥用價(jià)值。目前研究發(fā)現(xiàn)，油用牡丹籽提油后的副產(chǎn)物牡丹籽粕中含有多種茋類化合物，包括白藜蘆醇、suffruticosol A、suffruticosol B、suffruticosol C、trans-ε-viniferin、pauciflorol E、cis-ε-viniferin等[1]成分，具有抗真菌和細(xì)菌活性、抗氧化、抗腫瘤等作用。其中suffruticosol A對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901有抑制作用，suffruticosol C對(duì)Hepg2細(xì)胞生長活性有阻礙作用[2]。

細(xì)胞的增殖、分化、遷移都離不開信號(hào)分子在體內(nèi)的擴(kuò)散?？刂坪蛡鲗?dǎo)這些信號(hào)分子，對(duì)研究生物學(xué)過程有十分重要的意義。生物體內(nèi)，細(xì)胞所處環(huán)境是高度精確的，各種化學(xué)物質(zhì)如生長因子、胞內(nèi)蛋白信號(hào)等在時(shí)間和空間上不斷產(chǎn)生瞬時(shí)變化的濃度梯度。傳統(tǒng)的濃度梯度發(fā)生器有Zigmomd腔[2]、Boyden趨化小室[3]、Dunn腔[4]等。但這些發(fā)生器都是根據(jù)特定生物現(xiàn)象而設(shè)定，因此使用范圍有限，且產(chǎn)生的濃度梯度不穩(wěn)定[5]。

微流控芯片又稱芯片實(shí)驗(yàn)室，是一項(xiàng)在微米尺度空間對(duì)流體進(jìn)行操控的技術(shù)，以其高通量、高靈敏度、低消耗等優(yōu)點(diǎn)備受研究者關(guān)注[6]。近年來，濃度梯度微流控芯片技術(shù)逐漸興起，通過建立內(nèi)部可控、穩(wěn)定的濃度梯度，將細(xì)胞培養(yǎng)、藥物篩選等其他技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，用于多種細(xì)胞生物學(xué)研究[7]。Somaweera 等[8]設(shè)計(jì)制作了具有256個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔的濃度梯度微流控芯片，并對(duì)其功能進(jìn)行模擬與試驗(yàn)驗(yàn)證；Kim等[9]利用濃度梯度微流控芯片與細(xì)菌相結(jié)合，對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選有效的抗生素及劑量；Kilinic等[10]設(shè)計(jì)制作可產(chǎn)生多種溶質(zhì)的線性濃度梯度，研究A431表皮癌細(xì)胞表皮生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

目前鮮見有關(guān)以微流控芯片為平臺(tái)進(jìn)行牡丹籽粕低聚茋類化合物抗癌活性的報(bào)道。本文以所設(shè)計(jì)的濃度梯度微流控芯片為基礎(chǔ)，研究油用牡丹籽粕低聚茋類化合物對(duì)人源性乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)活性的抑制作用。另外，利用微流控芯片與細(xì)胞結(jié)合，能夠在體外模擬體內(nèi)微環(huán)境，且該芯片可一次性產(chǎn)生多種濃度梯度，并能實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性或凋亡的觀察。與傳統(tǒng)方法相比，節(jié)約樣品和試劑用量的同時(shí)也大大節(jié)省了研究時(shí)間；也為油用牡丹提油后副產(chǎn)物抗癌效果的研究利用提供一定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

牡丹籽，來自山西汾河牡丹實(shí)業(yè)股份有限公司提供的油用牡丹“鳳丹”種子。人源性乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

RTV615型聚二甲基硅氧烷(PDMS)、固化劑，購于美國Momentive Performance Materials公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，購于Biological Industries；雙抗和胰蛋白酶，購于全式金；吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)，購自凱基生物；PBS緩沖液，購自索萊寶；其他試劑均為分析純。試驗(yàn)所涉及細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的溶液均已進(jìn)行無菌處理。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，IKA-數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA)，SHZ-DШ循環(huán)水式真空泵，KW-4A型臺(tái)式勻膠機(jī)(中國科學(xué)院微電子研究所)，D2F-6020真空干燥箱，DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，CP313電子天平，TH4-200 OLYMPUS倒置熒光顯微鏡(日本)，數(shù)字注射泵。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低聚茋類化合物的提取

參照劉普等[11]的方法加以修改進(jìn)行油用牡丹籽粕低聚茋類化合物的提取。稱取適量牡丹籽粕粉，加入60%乙醇，利用閃式提取器進(jìn)行提取。將提取液離心，取上清，70℃條件下減壓蒸發(fā)除乙醇，剩余物經(jīng)真空冷凍干燥，稱重，用DMEM培養(yǎng)基(二甲基亞砜含量為0.5%)溶解，0.22 μm過濾，即為低聚茋類化合物提取液，4℃避光保存。

1.2.2 芯片的設(shè)計(jì)和制備

本試驗(yàn)通過AutoCAD(AutoCAD 2017)設(shè)計(jì)并繪制微流控芯片，中間兩個(gè)進(jìn)口，最外圈有8個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。繪制完成芯片，制備形成光掩膜。

圖1 芯片結(jié)構(gòu)示意圖

掩膜制作完成后，將PDMS預(yù)聚體底物A膠(Base)和固化劑B膠(Curing agent)按一定質(zhì)量比混合均勻注入膜中，抽真空排氣泡，放置烘箱，80℃烘烤約10 min固化，后將PDMS從原有模具上剝離，切割器切掉多余的PDMS部分，將切割好的芯片用打孔器進(jìn)行打孔；同時(shí)，按照質(zhì)量比12∶1再次稱取A膠和B膠，置于離心機(jī)內(nèi)均勻混合；倒入載玻片，烘箱中放置3～5 min，烘烤完畢后，將原先切割、打孔后的芯片置于已烘干好的載玻片相應(yīng)位置處，水平放置于烘箱中，加速雙層粘合，最后微流控芯片制作完畢。

1.2.3 濃度梯度的模擬

配制好的熒光素(100 μmol/L)和PBS在兩個(gè)入口處同時(shí)以一定流速通過注射泵注入芯片，倒置顯微鏡下對(duì)芯片管道進(jìn)行觀察并拍照，用Image-Pro? Plus 6.0處理圖片，依次計(jì)算每個(gè)通道的平均熒光強(qiáng)度。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與染色

依次用75%乙醇、無菌水沖洗芯片管道5次，紫外照射30 min，對(duì)芯片進(jìn)行消毒處理[12]。人源性乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)采用RPMI-1640培養(yǎng)基(血清10%)，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長至80%，用胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液。將制成的細(xì)胞懸液通入芯片內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)腔，待細(xì)胞貼壁完全，加入已制備的牡丹低聚茋類化合物，48 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。試驗(yàn)采用AO/PI雙染的方法鑒定細(xì)胞活力[13-15]。在此過程中，正常細(xì)胞與AO結(jié)合，呈現(xiàn)綠色，膜通透性破壞的細(xì)胞被PI染成紅色。

2 結(jié)果與討論

2.1 微流控芯片

PDMS材料被廣泛用于微流控芯片制作過程中。由于PDMS透氣性好，因此細(xì)胞在PDMS芯片上生長時(shí)所需氧氣可完全通過PDMS的通透性獲得，且PDMS具有良好的透光性和生物相容性[11]，有利于培養(yǎng)過程中對(duì)細(xì)胞的實(shí)時(shí)觀察。

設(shè)計(jì)的芯片由多個(gè)蜿蜒管道形成不同濃度梯度。整個(gè)芯片結(jié)構(gòu)由內(nèi)向外分為溶液進(jìn)口、梯度形成區(qū)和細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)。芯片含兩輪輻射狀管道，用于液體的充分混合；芯片高度50 μm，包含兩個(gè)進(jìn)口，在第一環(huán)管道處包含4個(gè)螺旋混勻管道，第二環(huán)管道處包含8個(gè)螺旋混勻管道。最外圈管道處連接著8個(gè)寬度700 μm、長度3 000 μm的細(xì)胞培養(yǎng)腔。圖2為制備的芯片實(shí)物圖。

圖2 芯片實(shí)物圖

2.2 芯片內(nèi)濃度梯度的模擬

利用軟件CFD-ACE模擬芯片管道內(nèi)濃度梯度分布圖，如圖3所示。

圖3 芯片內(nèi)濃度梯度模擬

從圖3可以看出，模擬結(jié)果表明培養(yǎng)腔1的藥液濃度百分比為0%，培養(yǎng)腔2和8藥液濃度百分比為25%，培養(yǎng)腔3和7藥液濃度百分比為50%，培養(yǎng)腔5藥液濃度百分比為100%。另外，通過熒光試驗(yàn)對(duì)軟件模擬結(jié)果進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。試驗(yàn)過程中，分別將熒光素和PBS以同樣流速從進(jìn)樣口注入，不同濃度液流經(jīng)分流、混合，最終形成5個(gè)濃度梯度。最后，對(duì)芯片內(nèi)8個(gè)培養(yǎng)腔進(jìn)行拍照，再利用Image-Pro? Plus 6.0分析芯片內(nèi)熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，培養(yǎng)腔1～5內(nèi)熒光強(qiáng)度呈比例逐漸增強(qiáng)。進(jìn)一步對(duì)芯片管道的上中下3部分分析得，芯片內(nèi)可形成穩(wěn)定熒光強(qiáng)度。

軟件CFD-ACE模擬結(jié)果和試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)，因此我們所設(shè)計(jì)的濃度梯度微流控芯片可用來產(chǎn)生精確的濃度梯度。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與進(jìn)樣

取100 μL細(xì)胞懸液(密度2×105mL-1)用于進(jìn)樣。待細(xì)胞完全進(jìn)入培養(yǎng)腔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。8～10 h即可完成細(xì)胞的貼壁，此時(shí)細(xì)胞呈不規(guī)則形。在持續(xù)灌流培養(yǎng)的條件下，細(xì)胞增殖。圖4為細(xì)胞培養(yǎng)24 h后芯片內(nèi)細(xì)胞貼壁情況。

從圖4可以看出，細(xì)胞貼壁緊密、長勢良好，形態(tài)正常、無懸浮的細(xì)胞碎片。表明該芯片適合細(xì)胞的正常生長，適宜進(jìn)行細(xì)胞相關(guān)研究，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果不會(huì)造成巨大誤差。

圖4 芯片中培養(yǎng)24 h后的MCF-7細(xì)胞

2.4 藥液對(duì)MCF-7細(xì)胞活性的作用

參照劉普等[11]的方法對(duì)油用牡丹籽粕進(jìn)行低聚茋類化合物的提取，用含二甲基亞砜(DMSO)的培養(yǎng)基配制藥液，質(zhì)量濃度為1 mg/mL。采用圖2所示微流控芯片裝置，進(jìn)口1加入藥液，進(jìn)口2加入PBS，通過注射泵持續(xù)灌流培養(yǎng)。

正常的細(xì)胞中細(xì)胞膜是完整的，起著溝通細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)和信息交流的作用。當(dāng)細(xì)胞活性下降時(shí)，細(xì)胞膜通透性改變。試驗(yàn)采用AO/PI熒光雙染的方法檢測不同質(zhì)量濃度梯度低聚茋類化合物作用細(xì)胞后細(xì)胞活性情況，鑒定細(xì)胞活力，結(jié)果見圖5、圖6。

從圖5可以看出，培養(yǎng)48 h后，低聚茋類化合物質(zhì)量濃度為0 mg/mL的芯片培養(yǎng)腔內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)正常、大小均勻，有高于95%的活細(xì)胞，與AO結(jié)合呈現(xiàn)綠色；低聚茋類化合物質(zhì)量濃度從0.25 mg/mL升高到1 mg/mL時(shí)，可觀察到細(xì)胞體積變小，細(xì)胞呈不規(guī)則形；質(zhì)量濃度的不斷增加，使得芯片內(nèi)正常細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞通透性增強(qiáng)，培養(yǎng)腔內(nèi)與PI結(jié)合的細(xì)胞越來越多，即呈現(xiàn)紅色的個(gè)數(shù)越多。

圖6 不同質(zhì)量濃度梯度低聚茋類化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響

從圖6可以看出，細(xì)胞染色后，通過Image-Pro? Plus 6.0對(duì)芯片管道內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，可知不同質(zhì)量濃度低聚茋類化合物作用MCF-7細(xì)胞48 h后，隨著低聚茋類化合物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞活力從97.56%下降到4.69%。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)以設(shè)計(jì)的濃度梯度微流控芯片為研究平臺(tái)，探究牡丹籽粕低聚茋類化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞的活性影響。藥液(低聚茋類化合物)和PBS分別從芯片進(jìn)口1與進(jìn)口2進(jìn)入，在梯度產(chǎn)生單元中逐級(jí)分配、混合，進(jìn)而生成多個(gè)質(zhì)量濃度梯度。結(jié)果表明：細(xì)胞活性與藥液質(zhì)量濃度梯度相關(guān)。隨著藥液質(zhì)量濃度的增大，細(xì)胞活性下降，芯片細(xì)胞培養(yǎng)腔內(nèi)細(xì)胞體積逐漸變小，細(xì)胞通透性增大。與傳統(tǒng)的研究濃度梯度與細(xì)胞活性的試驗(yàn)相比較，采用微流控芯片裝置研究癌細(xì)胞活性的同時(shí)，可獲取大量數(shù)據(jù)，能明顯降低試驗(yàn)試劑、細(xì)胞的消耗量，提高分析速度，加快研究進(jìn)度。為研究牡丹籽粕低聚茋類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的活性作用提供了大量的依據(jù)與理論基礎(chǔ)。