趙 會，章紹兵

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

水酶法提油是在機械破碎的基礎(chǔ)上，采用纖維素酶、蛋白酶等對油料種子進行酶解，最終得到油脂和具有特定功能水解蛋白的過程[1-2]。目前水酶法工藝得到的花生蛋白水解液中，多含有大量的可溶性糖、鹽和其他物質(zhì)，為了得到高純度的水解蛋白，必須進行純化處理。但水解蛋白相對分子質(zhì)量較小，無法通過酸沉的方法與其他可溶性糖類分開。而其他水解蛋白純化方法如大孔樹脂吸附、納濾等大多操作復(fù)雜、價格昂貴，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的擴大應(yīng)用[3-4]。

花生蛋白在等電點時溶解度最小，易形成沉淀?；ㄉ锌扇苄蕴侵饕姓崽?、葡萄糖、果糖等，單糖分子中有多個羥基，增加了其水溶性，尤其在熱水中溶解度大，而多糖是多元醇，每個糖單位都有結(jié)合水分子的能力，因此多糖具有較強的親水性，在水溶液中多糖顆粒吸水膨脹，然后部分溶解或完全溶解[5]。利用此原理，本文在花生酶解前設(shè)計了酸浸環(huán)節(jié)，旨在酶解前除去大部分可溶性糖和其他雜質(zhì)而將蛋白質(zhì)保留在沉淀中，之后再利用蛋白酶水解乳狀液和沉淀，最終可同時獲得花生油和純化的水解蛋白。本文研究了酸浸過程中影響可溶性糖脫除率和蛋白質(zhì)損失率的主要因素，優(yōu)化得到了水酶法加工花生過程中酸浸工藝的最佳條件，為實際生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

花生：市售，脂肪含量52.18%，蛋白質(zhì)含量27.8%，可溶性糖含量(10.79±0.15)%，水分含量3.47%。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、濃硫酸、蒸餾水等。

1.1.2 儀器與設(shè)備

722-G可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；FE20 pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；SHA-C水浴振蕩器，鞏義市予華儀器有限公司； DT5-4B離心機，北京時代北利離心機有限公司；KDN-1凱氏定氮儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酸浸工藝

將花生在190℃烘烤20 min，每隔5 min取出翻一次。將花生去皮之后充分粉碎成漿狀，取30 g花生漿于燒杯中，以適當(dāng)比例加入蒸餾水，攪拌均勻，使花生漿充分溶于水，調(diào)pH，在一定溫度的水浴振蕩器中進行酸處理，然后離心得到酸浸溶液，測定其中可溶性糖含量及蛋白質(zhì)含量。分別考察料液比、pH、處理時間、溫度對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響。

1.2.2 可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率計算

可溶性糖脫除率= 酸浸溶液中可溶性糖含量/花生中可溶性糖總量×100%

蛋白質(zhì)損失率= 酸浸溶液中蛋白質(zhì)含量/花生中蛋白質(zhì)總量×100%

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測定

凱氏定氮法，參照GB 5009.5—2010。

1.2.4 可溶性糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[6-7]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取7支具塞刻度試管，按順序分別加入不同體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水、苯酚和濃硫酸。將各試管搖勻，在室溫放置30 min后，在分光光度計上進行比色。調(diào)波長為490 nm，用0號管調(diào)零點，分別測出1～7號管的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶液中可溶性糖含量的測定：取1 mL酸浸溶液定溶于100 mL容量瓶中，混勻。吸取已定容的樣品0.6 mL置于25 mL比色管中，以蒸餾水補至2 mL，依次加入苯酚1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，混勻，在室溫放置30 min后，于490 nm處測定吸光度。每個樣品做3個平行樣。然后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其可溶性糖含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果以兩次以上結(jié)果的平均值表示，并使用SPSS 16.0 for Windows軟件進行單因素方差分析，P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

控制體系料液比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，在溫度50℃、pH 4.5條件下處理90 min后離心，測定可溶性糖脫除率與蛋白質(zhì)損失率。結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

從圖1可以看出，隨著水用量的增加，可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都呈明顯增加趨勢。對于可溶性糖，增加水用量的同時，多糖中羥基、環(huán)氧原子以及連接糖環(huán)的糖苷氧原子與水結(jié)合的機會也隨之增多，當(dāng)料液比超過1∶5以后，再增加水用量，可溶性糖脫除率增加幅度減緩。同時，繼續(xù)增加水用量會增加蛋白質(zhì)的損失。盡管酸浸的pH處在花生蛋白的等電點附近，但仍然會有少量蛋白質(zhì)不會沉淀，隨著水用量的增加，酸浸溶液中可溶性蛋白質(zhì)的量也將增加。

2.1.2 pH對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

控制體系pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，在料液比1∶5、溫度50℃條件下處理90 min后離心，測定可溶性糖脫除率與蛋白質(zhì)損失率。結(jié)果見圖2。

圖2 pH對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

從圖2可以看出，隨著pH的增加，可溶性糖脫除率變化并不顯著。而對于蛋白質(zhì)，在pH為4.5和5時損失率最低，這說明花生蛋白的等電點應(yīng)在此附近。在等電點時，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零，缺乏靜電推斥作用，因而疏水相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集和沉淀，溶解度最小[8]。

2.1.3 處理時間對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

在料液比1∶5、pH 5、溫度50℃條件下分別處理0、15、30、45、60 min后離心，測定可溶性糖脫除率與蛋白質(zhì)損失率。結(jié)果見圖3。

圖3 處理時間對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

從圖3可以看出，可溶性糖脫除率和蛋白質(zhì)損失率都隨處理時間的延長而上升，30 min以前上升較快，30 min以后趨于平緩。對于可溶性糖，剛開始時，多糖中羥基、環(huán)氧原子以及糖苷氧原子等與水快速形成氫鍵，隨著處理時間的延長，結(jié)合速度減慢，可溶性糖脫除率趨于平緩。對于蛋白質(zhì)，30 min以前，蛋白質(zhì)-水相互作用顯著，使蛋白質(zhì)溶解量快速增加，隨著處理時間的延長，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水相互作用逐漸達(dá)到平衡，蛋白質(zhì)損失率趨于平緩[9]。

2.1.4 溫度對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

控制體系溫度分別為30、40、50、60、70℃，在料液比1∶5、pH 5條件下處理30 min后離心，測定可溶性糖脫除率與蛋白質(zhì)損失率。結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，隨著溫度的升高，可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都呈上升趨勢。對于可溶性糖脫除率，40℃之前快速增長，40℃之后增長緩慢。對于可溶性糖，升溫可能破壞了多糖分子間的氫鍵，從而增加多糖與水之間形成氫鍵的機會，同時，分子做無規(guī)則運動的快慢與溫度有關(guān)，升溫能加快水分子運動速度，也能加快多糖與水、蛋白質(zhì)與水的接觸機會，從而加快了可溶性糖及蛋白質(zhì)的溶解速率[10]。

圖4 溫度對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率的影響

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以可溶性糖脫除率和蛋白質(zhì)損失率為考察指標(biāo)，選取料液比、pH、處理時間、溫度進行四因素三水平正交試驗?；ㄉ峤に嚨恼辉囼炓蛩厮揭姳?，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3、表4。

表1 正交試驗因素與水平

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 可溶性糖脫除率方差分析

表4 蛋白質(zhì)損失率方差分析

由表2可知，影響可溶性糖脫除率因素的主次順序為料液比>溫度>pH>處理時間，最佳工藝組合為A3B1C2D3。由表3可知，對于可溶性糖脫除率，料液比具有極顯著影響，溫度具有顯著影響，處理時間和pH影響不顯著。由表2可知，影響蛋白質(zhì)損失率因素的主次順序為溫度>料液比>pH>處理時間，最佳工藝組合為A1B2C1D2。由表4可知，對于蛋白質(zhì)損失率，料液比、pH、溫度具有極顯著影響，處理時間具有顯著影響。

從極差值和方差分析可以看出，對于可溶性糖，影響最大的是料液比，因此料液比選擇1∶6，pH對蛋白質(zhì)損失率有較大影響，選擇pH為5，溫度對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都有較大影響，但因為蛋白質(zhì)損失很少，所以首先考慮對可溶性糖脫除率的影響，即溫度選擇50℃，處理時間對兩者影響均較小，選擇處理時間為30 min。綜合考慮，酸浸工藝的最佳條件為A3B2C2D3，即料液比 1∶6、處理時間30 min、pH 5、溫度50℃。在最佳條件下做驗證試驗，可溶性糖脫除率為(83.11±0.33)%，蛋白質(zhì)損失率為(6.19±0.13)%。

3 結(jié) 論

(1)料液比對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都具有極顯著影響，隨著水用量的增加，可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都呈上升趨勢；pH對可溶性糖脫除率影響不顯著，但對蛋白質(zhì)損失率具有極顯著影響；處理時間對可溶性糖脫除率影響不顯著，但對蛋白質(zhì)損失率具有顯著影響；溫度對可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率有顯著或極顯著影響，隨著溫度的升高，可溶性糖脫除率及蛋白質(zhì)損失率都呈上升趨勢。

(2)通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化酸浸過程，確定酸浸工藝最佳條件為料液比 1∶6、處理時間30 min、pH 5、溫度50℃，此條件下可溶性糖脫除率為(83.11±0.33)%，蛋白質(zhì)損失率為(6.19±0.13)%。酸浸處理花生后可顯著減少花生蛋白中糖的含量，但同時也伴有少量蛋白質(zhì)損失。