趙保堂，牛 源，劉倩霞，劉 東，張 俊，張 繼

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，蘭州 730070； 2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

虹鱒魚為淡水魚，屬冷水性魚類，肉質(zhì)細嫩，味道鮮爽，富含人體所需的氨基酸和微量元素，并含有化栓去血垢的碳烯酸，適合三高人群食用。在淡水魚的加工過程中，可以利用的魚體僅占40%～50%，而剩余50%～60%的魚體(魚頭、魚尾、魚內(nèi)臟等)則成為了副產(chǎn)物[1]。絕大多數(shù)虹鱒魚加工副產(chǎn)物作為飼料或被直接丟棄，造成了資源的嚴重浪費與環(huán)境污染[2]。魚類內(nèi)臟中含有豐富的魚油，魚油中富含多不飽和脂肪酸，具有軟化心腦血管、降低患動脈粥樣硬化的作用[3-4]。隨著人們認識的不斷深入，魚油相關產(chǎn)品越來越暢銷，并進一步促進了人們對于魚油提取以及精煉方法的研究。

目前，國內(nèi)對魚油的提取分析文獻報道較多，但是對于虹鱒魚油提取分析的研究幾乎沒有文獻報道。對虹鱒魚內(nèi)臟中魚油提取分析，可豐富魚油的來源，提高魚油產(chǎn)量，不但能得到高利用價值的產(chǎn)品，又能減輕環(huán)境污染[5-6]。迄今為止，已經(jīng)報道的魚油的提取方法有壓榨法、稀堿水解法、索氏提取法和酶法等[5-7]。其中，索氏提取法與稀堿水解法為我國傳統(tǒng)淡水魚油提取的主要方法，該法雖然工藝條件比較成熟，但是在提取過程中產(chǎn)生的廢液、廢渣較多，且提取時間長，不能滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[8-11]。課題組成員前期采用超聲波輔助溶劑法對虹鱒魚油進行提取，結(jié)果表明，超聲波輔助法提取魚油雖然時間短、提取效率高，但需要對魚油進行脫溶劑處理，工藝復雜[12]。而酶法條件溫和、工藝路線簡單、無溶劑殘留，可同時提取油和蛋白質(zhì)，生產(chǎn)過程中能耗相對較低而且適用于工業(yè)化生產(chǎn), 具有廣闊的市場前景。本研究通過對虹鱒魚油的酶法提取工藝研究及其脂肪酸組成分析，旨在獲得最佳的工藝條件，為后續(xù)的研究分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

虹鱒魚內(nèi)臟：購于蘭州市永登縣，去除膽囊及腸道內(nèi)消化物，洗凈瀝干，并用絞肉機絞碎成糜狀，冷藏備用。

木瓜蛋白酶(BR，800 U/mg)，上海禾午生物科技有限公司；胰蛋白酶(BR，250 U/mg)，上海谷研科技有限公司；胃蛋白酶(BR，3 000 U/mg)，湖南匯百侍生物科技有限公司。無水乙醇、甲醇、異辛烷，色譜純；石油醚(沸程60～90℃)、乙醚、氫氧化鉀、鹽酸、硫酸氫鈉、硫酸鈉、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉，均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

FA1104N電子分析天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；磁力攪拌器，上海森信實驗儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；GC-MS 6800氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 虹鱒魚內(nèi)臟含油量的測定

準確稱取虹鱒魚內(nèi)臟5.0 g，用濾紙包裹嚴實，置于索氏抽提器中，按照索氏提取法加入石油醚(沸程60～90℃)使包裹物完全浸沒在石油醚中，水浴加熱提取8 h，將提取后的液體用分液漏斗分離水分后，減壓蒸發(fā)揮去石油醚，稱量并計算虹鱒魚內(nèi)臟含油量。

1.2.2 虹鱒魚油的酶法提取

準確稱取虹鱒內(nèi)臟5.0 g，置于50 mL錐形瓶中，加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，加入酶，在一定溫度下對其進行酶解一定時間，進行滅酶處理，經(jīng)抽濾除去廢渣后，用分液漏斗進行油水分離，分離出油層，加入無水硫酸鈉除去水分，稱魚油質(zhì)量，根據(jù)下式計算魚油提取率。

提取率=提取得到的魚油質(zhì)量/虹鱒魚內(nèi)臟含魚油質(zhì)量×100%

1.2.3 酸價和過氧化值的測定

酸價參照GB 5009.229—2016測定，過氧化值參照GB 5009.227—2016測定。

1.2.4 脂肪酸組成的測定

1.2.4.1 脂肪酸甲酯的制備

脂肪酸甲酯參考張靜等[13]的方法制備。

1.2.4.2 分析條件

GC條件：色譜柱為RTX-5MS 型彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣量為2.5 μL；程序升溫為柱溫160℃，保留2 min，然后以5℃/min 升至210℃，保留3 min，再以1℃/min升至220℃，保留1 min，最后以5℃/min 升至250℃，保留1 min。

MS條件：離子源為EI源，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃。

1.2.5 統(tǒng)計分析

所有的實驗都進行3次重復，所得數(shù)據(jù)取平均值。采用Design-Expert 8.0及Excel軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酶種類對虹鱒魚油提取率的影響

稱取 5.0 g虹鱒魚內(nèi)臟，在液料比4∶1、加酶量2%、酶解時間60 min條件下，分別采用胃蛋白酶(酶解pH 2.0，酶解溫度37℃)、木瓜蛋白酶(酶解pH 6.0，酶解溫度65℃)、胰蛋白酶(酶解pH 8.0，酶解溫度37℃)提取虹鱒魚油，研究酶種類對魚油提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 酶種類對虹鱒魚油提取率的影響

由圖1可知，采用的酶不同，提取率也有所不同，其中木瓜蛋白酶處理的魚油提取率最高，達到了87.15%。不同蛋白酶的水解能力不同，主要是因為不同酶對肽鍵的專一性不同，木瓜蛋白酶的專一性最為廣泛，能很好地水解肽鍵[5]。白鑫華等[14]在提取大鯢魚油過程中，也發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶專一性最為廣泛，且很好地水解了肽鍵。因此，選取木瓜蛋白酶進行后續(xù)實驗。

2.1.2 不同酶解時間對虹鱒魚油提取率的影響

在酶解溫度60℃、pH 6.5、加酶量2%，液料比4∶1的條件下，研究不同酶解時間(30、60、90、120、150 min)對魚油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酶解時間對虹鱒魚油提取率的影響

由圖2可知，在酶解60 min內(nèi)魚油提取率快速增加，在酶解時間60 min時提取率達到82.30%。原因在于隨著酶解時間的延長，酶與底物充分反應，破壞了脂肪和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)關系。隨著酶解時間的繼續(xù)延長，魚油提取率變化不大。王倩倩等[8]在羅非魚油的提取中，也證明酶與底物的反應會隨著酶解時間的延長而使油脂釋放得更加充分。因此，從能耗和提取率增加量等角度考慮，選取60 min為適宜的酶解時間。

2.1.3 不同液料比對虹鱒魚油提取率的影響

在酶解時間60 min、酶解溫度60℃、pH 6.5、加酶量2%的條件下，研究不同液料比(1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1)對虹鱒魚油提取率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，魚油提取率在液料比為1∶2時最低，液料比為4∶1時提取率達到最大，為85.06%。繼續(xù)增加液料比，提取率呈現(xiàn)下降趨勢。因此，選取4∶1為適宜的液料比。

圖3 液料比對虹鱒魚油提取率的影響

2.1.4 不同酶解溫度對虹鱒魚油提取率的影響

在酶解時間60 min、pH 6.5、加酶量2%、液料比4∶1的條件下，研究不同酶解溫度(40、50、60、70、80℃)對魚油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解溫度對虹鱒魚油提取率的影響

由圖4可知，酶解溫度在40～50℃時，魚油提取率顯著增加。隨著酶解溫度的繼續(xù)升高，魚油提取率趨于上升。當酶解溫度高于60℃時，魚油提取率趨于下降，表明溫度升高的同時，酶失活速度也上升。故選擇60℃作為適宜的酶解溫度。

2.1.5 不同加酶量對虹鱒魚油提取率的影響

在酶解時間60 min、酶解溫度60℃、pH 6.5、液料比4∶1的條件下，研究不同加酶量(1%、2%、3%、4%、5%)對魚油提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 加酶量對虹鱒魚油提取率的影響

由圖5可知，隨著加酶量的增多，魚油提取率顯著上升。加酶量為2%時，魚油提取率達到最高。之后隨著加酶量的繼續(xù)增多，魚油提取率緩慢降低。故選擇2%為適宜加酶量。

2.1.6 不同pH對虹鱒魚油提取率的影響

在酶解時間60 min、酶解溫度60℃、加酶量2%、液料比4∶1的條件下，研究不同酶解pH(5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)對魚油提取率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 pH對虹鱒魚油提取率的影響

由圖6可知，酶解pH在5.5～6.5的范圍內(nèi)，隨著pH的升高，魚油提取率也隨之升高，表明pH升高能促進蛋白水解，將油脂釋放出來。pH為6.5時，魚油提取率最高。隨著pH的進一步提高，魚油提取率趨于下降，反映出每種酶都有特定適應的pH范圍。因此，選擇pH 6.5為適宜酶解pH。

2.2 響應面實驗

2.2.1 回歸方程的建立及模型方差分析

在單因素實驗結(jié)果的基礎上，采用木瓜蛋白酶，固定液料比4∶1，以虹鱒魚油提取率為目標函數(shù)Y，以酶解溫度、酶解時間、pH、加酶量4個因素對應變量X1、X2、X3、X4，采用四因素三水平的響應面分析法優(yōu)化酶法提取虹鱒魚油的工藝條件，響應面實驗因素與水平見表1,響應面實驗設計與結(jié)果見表2。

表1 響應面實驗因素與水平

運用Design-Expert 8.0軟件，得到虹鱒魚油提取率回歸方程的方差分析如表3所示。

表2 響應面實驗設計與結(jié)果

表3 方差分析

注：***p<0.000 1,差異極顯著;**p<0.01，差異高度顯著;*p<0.05，差異顯著。

2.2.2 驗證實驗

將回歸方程各自應變量取一階偏導為0，得到的最佳酶解工藝條件為：酶解時間61.42 min，酶解溫度61.52℃，pH 7.04，加酶量2.190%。考慮到實際操作的便利，將酶解參數(shù)修訂為酶解時間61 min、酶解溫度 61℃、pH 7.0、加酶量 2.2%。對優(yōu)化后的工藝條件進行驗證實驗，重復5次，虹鱒魚油平均提取率為88.67%。與課題組前期對虹鱒魚內(nèi)臟采用超聲波輔助法(超聲功率200 W、超聲時間58 min、超聲溫度55℃、液料比為12∶1，虹鱒魚油的最佳提取率為95.10%)相比，在相同的時間內(nèi)，酶法的提取率較低，主要是因為在酶法提取過程中，由于較多虹鱒魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)溶出，導致形成穩(wěn)定的乳狀液，使魚油提取率降低[12]。酶法提取得到的虹鱒魚油呈淺黃色、稍有渾濁，具有魚油腥味、無酸敗味，酸價(KOH)和過氧化值分別為3.68 mg/g和1.75 mmol/kg，符合SC/T 3502—2016粗魚油一級標準。

2.3 虹鱒魚油的脂肪酸組成分析

對酶法提取的虹鱒魚油進行脂肪酸組成分析，結(jié)果如表4所示。由表4可知，虹鱒魚油主要由C14～C22脂肪酸組成，其中多不飽和脂肪酸中亞油酸相對含量最高，為26.75%，其次為亞麻酸，相對含量為8.93%，DHA相對含量為4.48%，EPA相對含量為0.97%。單不飽和脂肪酸油酸的相對含量為19.99%。與課題組前期對超聲波輔助法提取的虹鱒魚油的脂肪酸組成(油酸20.09%，亞油酸26.42%，亞麻酸9.24%，EPA 1.12%，DHA 4.45%)相比，兩者從組成到含量均無明顯差異，但酶法提取具有無溶劑殘留、工藝路線簡單，可同時提取油和蛋白質(zhì)等優(yōu)點[12]。

表4 虹鱒魚油主要脂肪酸組成

3 結(jié) 論

本文以虹鱒魚內(nèi)臟為原料，以虹鱒魚油提取率為指標，在單因素實驗的基礎上，經(jīng)過響應面法優(yōu)化確定酶法提取虹鱒魚油的最佳工藝條件為：采用木瓜蛋白酶，液料比4∶1，酶解時間 61 min，酶解溫度61℃，酶解pH 7.0，加酶量2.2%。在最佳工藝條件下，虹鱒魚油提取率達88.67%。提取得到的虹鱒魚油呈淺黃色、稍有渾濁，具有魚油腥味、無酸敗味，酸價(KOH)和過氧化值分別為3.68 mg/g和1.75 mmol/kg，符合SC/T 3502—2016粗魚油一級標準。同時GC-MS分析顯示，酶法提取的虹鱒魚油主要不飽和脂肪酸組成為油酸19.99%、亞油酸26.75%、亞麻酸 8.93%、DHA 4.48%、EPA 0.97%。在后續(xù)工作中，將繼續(xù)優(yōu)化酶解條件以提高虹鱒魚油提取率，同時回收水相中蛋白質(zhì)，從而推動酶法提油在虹鱒魚油中的工業(yè)化應用。