韓海濤，宴正明，張潤光，戚登斐，楊 濤，張有林

(1.陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安 710119； 2.陜西省林業(yè)科學院，西安 710082)

核桃(JuglanslegiaL.)又名胡桃，起源于亞洲西部[1]，在我國種植面積廣泛，截至2015年底，栽培面積320萬hm2，年產(chǎn)量290萬t[2]，居世界首位。核桃除直接食用外，還用來榨取核桃油。核桃仁冷榨取油后的核桃餅，依然保留大部分營養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量高達50%，且18種氨基酸齊全，精氨酸含量很高[3-5]，這些成分對人體具有良好的保健功能[6-8]。但目前我國核桃餅粕多用作肥料或飼料，造成優(yōu)質(zhì)蛋白資源極大浪費[9]。

蛋白質(zhì)中可溶性組分與蛋白質(zhì)的功能特性密切相關(guān)。大豆蛋白中的7S球蛋白具有良好的乳化性，決定了大豆蛋白的凝膠特性[10]。綠豆清蛋白、玉米醇溶蛋白、燕麥球蛋白等因其特殊的理化性質(zhì)被廣泛應用于食品加工。蛋白的溶解度影響其功能特性，一般溶解性好的蛋白質(zhì)更有利于廣泛應用。添加溶解度高的蛋白可提高飲料制品的營養(yǎng)價值，且具有透明度好、黏度高等優(yōu)點[11]。目前，利用植物蛋白分離組分的特殊功能生產(chǎn)多元功能產(chǎn)品已屢見不鮮。

在蛋白保健功能研究方面，多種蛋白以及相關(guān)的多肽產(chǎn)品被廣泛應用。從綠豆蛋白中分離抗氧化活性肽[12]，大豆多肽具有降血壓、降膽固醇等功能[13]，從海地瓜蛋白、金槍魚蛋白中分離ACE抑制肽[14-15]。核桃蛋白具有一定的抗氧化性，并能有效防御心血管疾病、肥胖癥、糖尿病等多種疾病[16-18]。核桃蛋白具有藥食同源性，且可以改善食品原有品質(zhì)，但針對其組分分離的研究少有報道。本研究分離與純化核桃粕中的主要蛋白質(zhì)，并研究這些蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值、功能特性及抗氧化性，旨在為核桃蛋白的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

“清香”核桃，購于安康市漢濱區(qū)瀛湖鎮(zhèn)。

硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、石油醚、乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、氯化亞鐵、冰乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、考馬斯亮藍G250、牛血清白蛋白、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，均為分析純。

Kjeltec2300型全自動凱氏定氮儀，瑞典福斯公司；L-8900全自動氨基酸分析儀，日本Hitachi公司；DL-4C低速大容量離心機，奧林巴斯公司；XHF-D高速分散器；RF-6000熒光分光光度計，日本島津公司；PHS-3C精密pH計；QL-866旋渦混合器。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃蛋白的分離與純化

將核桃仁粉碎，用液壓榨油機冷榨50 min取油后得到核桃餅，粉碎。取一定量核桃餅粉，按料液比1∶5加入石油醚，振蕩3 h，抽濾，重復兩次，45℃烘干得到脫脂核桃粕。采用Kumar等[19]的方法，收集核桃總蛋白。采用王美玉等[20]的方法，分別收集清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白-1、谷蛋白-2溶液。將總蛋白、球蛋白、谷蛋白-1及谷蛋白-2溶液透析48 h。將所有蛋白組分凍干，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氨基酸組成測定

利用凱氏定氮法測定各組分的蛋白質(zhì)含量，按照謝藍華等[21]的方法測定氨基酸含量。并計算非極性氨基酸含量(NPS)和極性氨基酸含量與非極性氨基酸含量的比率(P)。

1.2.3 溶解度測定

用pH 7.0的PB緩沖液(0.01 mol/L)將核桃蛋白配制成1 mg/mL溶液，攪拌30 min，于4℃、8 000 r/min離心20 min，收集上清液，用凱氏定氮法測定上清液及樣品中蛋白質(zhì)含量并計算氮溶指數(shù)(NSI)。

NSI=上清液蛋白質(zhì)含量/樣品中蛋白質(zhì)含量×100%

1.2.4 表面疏水性測定

疏水性的測定采用ANS熒光探針法[22]。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，所得曲線的斜率即為核桃蛋白組分的表面疏水性指數(shù)。

1.2.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

采用濁度法測定5種核桃蛋白組分在不同NaCl濃度下的乳化性及乳化穩(wěn)定性。

乳化性(EAI)=2.303×2×A0×稀釋因子/(C×Φ×10 000)

乳化穩(wěn)定性(ESI)=At/A0×100%

式中：C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，1 mg/mL；Φ為組分蛋白對應乳狀液的油體積(0.25)；稀釋因子為50；A0為500 nm下稀釋的乳狀液的吸光值；At為500 nm下稀釋的乳狀液10 min后的吸光值。

1.2.6 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定

取30 mL 0.5 mg/mL的蛋白樣品，NaCl濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol/L，均質(zhì)(10 000 r/min，1 min)，記錄均質(zhì)停止時體積(V0)以及10 min后泡沫的體積(Vt)，計算起泡性及泡沫穩(wěn)定性。

起泡性(FC)=V0/30×100%

泡沫穩(wěn)定性(FS)=Vt/V0×100%

1.2.7 DPPH自由基清除率測定

參照文獻[23]測定核桃蛋白組分的DPPH自由基清除率，以0.4 mg/mL丁羥甲苯(BHT)作對照。

1.2.8 還原力測定

量取1 mL樣品溶液(0.5 mg/mL)、2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、2.5 mL鐵氰化鉀溶液(10 mg/mL，0.1%)混勻，將混合物在50℃下水浴20 min。在混合物中加入2.5 mL TCA(100 mg/mL)，4 000 r/min下離心10 min。取上清液、蒸餾水和氯化鐵(10 mg/mL，0.1%)各2.5 mL混合，反應10 min后測定700 nm處吸光值?？瞻讓φ詹患勇然F，空白對照為0.1 mg/mL丁羥甲苯(BHT)，以吸光值反映還原力。

1.2.9 羥基自由基清除率測定

參照文獻[24]測定核桃蛋白組分的羥基自由基清除率。

1.2.10 超氧陰離子自由基清除率測定

參照文獻[25]測定核桃蛋白組分的超氧陰離子自由基清除率。

1.2.11 金屬螯合性測定

將1 mL的樣品(0.5 mg/mL)加入蒸餾水至2.8 mL，并添加50 μL 2 mmol/L的FeCl2和150 μL 2 mmol/L的菲啰嗪，10 min后在波長562 nm處測吸光值A(chǔ)t，以1 mL蒸餾水代替樣品作為空白對照，測其吸光值A(chǔ)0。計算金屬離子整合率。

螯合率=(1-At/A0)×100%

1.2.12 營養(yǎng)價值評價

蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的評價方法主要有生物學法和氨基酸分析評價法。根據(jù)核桃所含主要蛋白質(zhì)的類型，本文采用氨基酸分析評價法[26]，通過測定核桃粕蛋白質(zhì)體外消化率(IVPD)、必需氨基酸含量等參數(shù)，并與FAO/WHO推薦的氨基酸含量對比評價其營養(yǎng)價值[27]。體外消化率采用雙酶法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃餅粕中主要成分及含量(見表1)

表1 核桃餅粕中主要成分及含量 %

由表1可知，核桃餅中蛋白質(zhì)含量為48.64%，脫脂核桃粕中蛋白質(zhì)含量為60.05%。此外，脫脂核桃粕提取可溶性蛋白質(zhì)組分得到6.63%清蛋白、14.89%球蛋白、5.81%醇溶蛋白、21.9%酸性谷蛋白(谷蛋白-1)和50.77%堿性谷蛋白(谷蛋白-2)，由此看出谷蛋白是核桃蛋白的主要成分，尤其是堿性谷蛋白，這與Sze-Tao等[28]研究結(jié)果略有不同，可能是原料差異所致。

2.2 核桃蛋白組分營養(yǎng)價值與理化性質(zhì)

2.2.1 核桃蛋白組分氨基酸組成與營養(yǎng)特征(見表2)

表2 核桃蛋白組分氨基酸組成及營養(yǎng)特征

注：*代表必需氨基酸；非極性氨基酸包括纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸、脯氨酸；其他為極性氨基酸。

由表2可以看出，5種蛋白質(zhì)組分中氨基酸含量最高的為谷氨酸，其次為精氨酸。清蛋白和醇溶蛋白的氨基酸組成類似，兩者的體外消化率(IVPD)雖然較高，但是由于氨基酸組成不夠均衡，營養(yǎng)價值整體偏低。谷蛋白-1與醇溶蛋白天冬氨酸含量較高，谷蛋白-1的芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)含量和必需氨基酸含量在5種蛋白組分中最高，谷蛋白-1的NPS值最高，P值最低。

2.2.2 核桃蛋白組分的功能特性

在室溫、pH 7.0條件下測定核桃蛋白各組分的溶解度。在室溫、NaCl濃度0 mol/L下測定核桃蛋白各組分的乳化特性和起泡特性，結(jié)果見表3。

表3 核桃蛋白組分的功能特性

由表3可以看出，5種核桃蛋白組分中，清蛋白、谷蛋白-2以及醇溶蛋白的表面疏水性較高，谷蛋白-1最低。清蛋白的氮溶指數(shù)最高，為61.21%，從整體上看，核桃蛋白組分的溶解性較差，原因可能是原料中存在酚類與單寧類物質(zhì)。5種蛋白均顯示出良好的乳化性和乳化穩(wěn)定性，其中谷蛋白-2的乳化性最高，其次是清蛋白，5種蛋白良好的乳化性可能與其較高的表面疏水性有關(guān)，蛋白質(zhì)分子可以快速進入油相和水相界面形成乳化層，表現(xiàn)出良好的乳化性。球蛋白的乳化穩(wěn)定性最高，其次是醇溶蛋白。谷蛋白-2和球蛋白具有相對較好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，醇溶蛋白和谷蛋白-1起泡性和泡沫穩(wěn)定性較差。

2.2.3 NaCl濃度對核桃蛋白組分乳化特性、起泡特性的影響(見圖1～圖4)

圖1 核桃蛋白組分的乳化性與NaCl濃度之間的關(guān)系

圖2 核桃蛋白組分的乳化穩(wěn)定性與NaCl濃度之間的關(guān)系

圖3 核桃蛋白組分的起泡性與NaCl濃度之間的關(guān)系

圖4 核桃蛋白組分的泡沫穩(wěn)定性與NaCl濃度之間的關(guān)系

由圖1、圖2可以看出，不同核桃蛋白組分，NaCl濃度對其乳化特性的影響不同。谷蛋白-2的乳化性隨著NaCl濃度的增加急劇降低，清蛋白的乳化性隨NaCl濃度的增加而緩慢下降，谷蛋白-1的乳化性在NaCl濃度0～0.4 mol/L隨NaCl濃度增加而升高，在0.4～0.6 mol/L隨NaCl濃度增加而下降，球蛋白與醇溶蛋白的乳化性在NaCl濃度0～0.2 mol/L隨濃度增加而升高，在0.2～0.4 mol/L隨濃度增加而下降，在0.4～0.6 mol/L趨于平穩(wěn)。清蛋白與谷蛋白-1的乳化穩(wěn)定性在NaCl濃度0～0.2 mol/L隨濃度增加而升高，在0.2～0.4 mol/L隨濃度增加而下降，在0.4～0.6 mol/L隨濃度增加而上升。球蛋白的乳化穩(wěn)定性在NaCl濃度0～0.2 mol/L隨濃度增加而下降，在0.2～0.6 mol/L隨濃度增加而升高，醇溶蛋白的乳化穩(wěn)定性在NaCl濃度0～0.4 mol/L隨濃度增加而升高，在0.4～0.6 mol/L隨濃度增加而下降。原因可能是不同NaCl濃度下各蛋白組分的表面疏水性發(fā)生了變化，從而影響了乳化性與乳化穩(wěn)定性。

由圖3、圖4可以看出，5種核桃蛋白組分中，谷蛋白-2和球蛋白具有相對較好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，二者的起泡性在NaCl濃度0～0.4 mol/L時隨濃度增加而升高，在NaCl濃度0.4～0.6 mol/L時隨濃度增加而降低。谷蛋白-2的泡沫穩(wěn)定性在NaCl濃度0～0.1 mol/L隨濃度增加而下降，在0.1～0.4 mol/L隨濃度增加而升高，在0.4～0.6 mol/L隨濃度增加而下降。球蛋白的泡沫穩(wěn)定性在NaCl濃度0～0.2 mol/L隨濃度增加而升高，在0.2～0.3 mol/L隨濃度增加而下降，在0.3～0.6 mol/L隨濃度增加而緩慢升高。醇溶蛋白、清蛋白、谷蛋白-1的起泡性和泡沫穩(wěn)定性較差。原因可能是不同NaCl濃度下蛋白質(zhì)發(fā)生“鹽溶”“鹽析”的結(jié)果。

2.3 核桃蛋白組分的抗氧化性(見表4)

表4 核桃蛋白組分的抗氧化性

注：同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

由表4可知，在相同質(zhì)量濃度下，清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白-2的DPPH自由基清除能力最高，分別是97.15%、93.35%和90.58%，明顯高于BHT的(73.50%)，很可能是因為這3種蛋白具有較高的表面疏水性。而球蛋白和谷蛋白-1的DPPH自由基清除率較低，可能是因為其表面疏水性較低。

有研究[29]表明，抗氧化活性和還原力之間可能存在正相關(guān)性，可以通過還原力的大小來表示抗氧化活性的強弱。由表4可知，醇溶蛋白的還原力最高，且顯著高于BHT的，可以作為良好的抗氧化劑，其次是球蛋白。

在相同質(zhì)量濃度下，5種核桃蛋白組分的羥基自由基清除活性大小順序為醇溶蛋白>球蛋白>谷蛋白-2>谷蛋白-1>清蛋白。其中，醇溶蛋白對羥基自由基的清除能力(111.2%)明顯超過BHT的(77.31%)。羥基自由基清除活性與一些生理活性有直接關(guān)系，具有一定的羥基自由基清除活性，很有可能具有ACE抑制活性[30]。

5種核桃蛋白組分的超氧陰離子自由基清除率大小順序為谷蛋白-1>谷蛋白-2 >醇溶蛋白>球蛋白>清蛋白，并且均高于BHT的。

金屬離子在自由基氧化過程中充當催化劑，因此將其螯合可降低其催化作用。由表4可知，5種核桃蛋白組分對金屬離子的螯合能力均低于對照BHT的。

3 結(jié) 論

從核桃粕中提取5種核桃蛋白組分，對其營養(yǎng)價值、功能特性及抗氧化性進行測定。5種蛋白質(zhì)氨基酸組成中，谷氨酸含量最高，精氨酸次之。谷蛋白-2的乳化性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性最佳，分別為278.66 m2/g、50.03%、60.01%。球蛋白乳化穩(wěn)定性最高，為75.27%。清蛋白對DPPH自由基清除能力最高，清除率為97.15%，其次為醇溶蛋白，清除率為93.35%，均高于BHT的(73.50%)，醇溶蛋白金屬螯合性雖低于BHT，但還原力高于BHT，抗氧化活性和還原力之間存在正相關(guān)性，說明醇溶蛋白可以作為良好的抗氧化劑。