相偉芳，楊藝新，郭美琪，張新玥，李 敏，潘麗娜

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

美國白蛾Hyphantriacunea（Drury）又名美國燈蛾，屬鱗翅目（Lepidoptera）燈蛾科（Arctiidae）[1]，具有食性雜、繁殖量大及適應(yīng)性強等特點，是一種對林業(yè)和農(nóng)業(yè)造成嚴重危害的世界性檢疫害蟲[2].1979年，美國白蛾首次在我國被發(fā)現(xiàn)，隨后擴散到我國的其他地區(qū)并造成嚴重危害[3-4].為了減輕美國白蛾的危害，楊忠岐[5]連續(xù)多年對該害蟲的天敵進行調(diào)查，最終在陜西地區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種新的美國白蛾寄生蜂—白蛾周氏嚙小蜂（Chouioia cuneaYang）.白蛾周氏嚙小蜂屬姬小蜂科（EuloPhidae）嚙小蜂屬（Tetrastichus），是美國白蛾蛹期的重要寄生性天敵[6]，在控制美國白蛾的數(shù)量方面起著重要作用.目前，白蛾周氏嚙小蜂已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于美國白蛾的防治中并取得顯著成效[7].白蛾周氏嚙小蜂主要通過嗅覺系統(tǒng)定位寄主.昆蟲的嗅覺系統(tǒng)主要包括氣味結(jié)合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs）、化學感受蛋白（Chemosensory proteins，CSPs）、神經(jīng)元膜蛋白（Sensoryneuronmembraneproteins，SNMPs）及氣味受體（Olfactory receptors,ORs）蛋白等[8].氣味分子進入感器淋巴液中，與淋巴液中的氣味結(jié)合蛋白結(jié)合，激活嗅覺神經(jīng)元膜上的氣味受體，產(chǎn)生動作電位，從而引起一系列的行為反應(yīng)[9].氣味結(jié)合蛋白可以與氣味分子特異結(jié)合，對氣味分子起到初步的過濾作用，是昆蟲嗅覺識別過程中關(guān)鍵的一步.因此，OBPs與氣味分子的結(jié)合是本領(lǐng)域的研究熱點.關(guān)于白蛾周氏嚙小蜂對美國白蛾氣味識別的研究已有一些報道.如Zhao等[10]首次對雌雄白蛾周氏嚙小蜂的觸角進行了測序，共測定出25個氣味結(jié)合蛋白、80個氣味受體、10個離子受體（Ionotropic receptors，IRs）、11個化學感受蛋白、1個神經(jīng)元膜蛋白和17個味覺受體（Gustatory receptors，GRs）.Zhu等[11]對美國白蛾蛹、老熟幼蟲和蟲糞的揮發(fā)物進行了檢測，共測定出了18種化合物.趙燕妮等[12]和張新玥等[13]在此基礎(chǔ)上分別對氣味結(jié)合受體CcOR83b和CcOR1進行了分子進化分析.王鳳竹等[14]對氣味結(jié)合蛋白CcOBP1進行了進化分析.

分子對接技術(shù)是近年來被應(yīng)用于昆蟲嗅覺研究的生物分析技術(shù)，它通過構(gòu)建蛋白質(zhì)與小分子化合物的三維結(jié)構(gòu)，將小分子匹配到蛋白質(zhì)的結(jié)合位點上，通過計算結(jié)合力來篩選與蛋白結(jié)合的小分子物質(zhì)[15].如Li等[16]利用分子對接技術(shù)研究了中華蜜蜂（Apis cerana）的化學感受蛋白CSP1；Du等[17]利用該技術(shù)探究了含雜環(huán)的（E）-β-法尼烯類似物與蚜蟲氣味結(jié)合蛋白的結(jié)合模式.

目前，對于白蛾周氏嚙小蜂嗅感蛋白的研究較少.本研究選取白蛾周氏嚙小蜂雌雄觸角均大量表達的一個氣味結(jié)合蛋白CcOBP3，通過軟件預測及分子對接技術(shù)，對CcOBP3進行多角度分析，為探明CcOBP3的結(jié)合特性提供理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)的白蛾周氏嚙小蜂嗅覺機制的研究積累數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 Cc OBP3序列分析

1.1.1 材料

CcOBP3堿基序列由本課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對雌雄白蛾周氏嚙小蜂的觸角進行測序獲得[10].選取美國白蛾蛹、老熟幼蟲和蟲糞的揮發(fā)物以及常見的植物揮發(fā)物共8種小分子物質(zhì)用于CcOBP3的分子對接.美國白蛾的揮發(fā)物[11]包括：鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，C10H10O4）、正戊醛（Valeraldehyde，C5H10O）、十六烷（n-Hexadecane，C16H34）、正十五烷（n-Pentadecane，C15H32）、正十四烷（Etradecane，C14H30）.植物揮發(fā)物[18-20]包括：苊（Acenaphthene，C12H10）、3-蒈烯（3-Carene，C10H16）和丁酸丁酯（n-Butylbutyrate，C8H16O2）.

1.1.2 方法

應(yīng)用Bio Edit分析CcOBP3序列的氨基酸殘基數(shù)及相對分子質(zhì)量；EXPASY平臺中的SignalP3.0 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）用于預測信號肽 及其 所在位 置；HMMTop（http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html）用于預測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域.

1.2 分子對接

1.2.1CcOBP3同源建模及模型評價

將CcOBP3的氨基酸序列作為建模模板，在Swiss-Model（http://swissmodel.expasy.org/）上對CcOBP3進行同源建模[21]，獲得蛋白的三維結(jié)構(gòu).用Ramachandran圖評價CcOBP3蛋白三維結(jié)構(gòu)的質(zhì)量[22].

1.2.2CcOBP3分子對接

美國白蛾揮發(fā)物以及常見的植物揮發(fā)物共8種小分子物質(zhì)用于CcOBP3的分子對接.從Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載8種小分子的三維結(jié)構(gòu)[23]，準備進行分子對接.首先用Schrodinger Suites 2015-2中的maestro10.2軟件將CcOBP3的三維結(jié)構(gòu)導入，手動輸入蛋白三維結(jié)構(gòu)具體坐標并進行調(diào)整，盡可能使蛋白的活性中心位于盒子的中心，生成文件保存.然后導入8種小分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，搜索小分子物質(zhì)的其他構(gòu)象，生成文件保存.最后用maestro10.2進行分子對接，Pymol v1.3顯示對接結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 CcOBP3序列分析結(jié)果

CcOBP3的開放閱讀框為453 bp，編碼150個氨基酸，相對分子質(zhì)量為16 747.90.軟件預測該蛋白有信號肽，位于第28~29位氨基酸殘基之間，如圖1所示.CcOBP3含有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，位于第7~23位氨基酸殘基上.

圖1 Cc OBP3的信號肽位置預測結(jié)果Fig.1 Prediction results of Cc OBP 3 signal peptide position

2.2 CcOBP3分子對接結(jié)果

2.2.1CcOBP3同源建模結(jié)果

利用Swiss-Model在線搜索白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP3最佳模型的模板.結(jié)果表明，意大利蜜蜂（Apis mellifera）的氣味結(jié)合蛋白OBP5（ID:3r72.1）與白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP3的相似度最高，為36.75%.一般來說，模型的相似度在30%以上便可獲得相對合理的構(gòu)象[24].因此，意大利蜜蜂的氣味結(jié)合蛋白OBP5可作為白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP3的模板，通過Swiss-Model構(gòu)建白蛾周氏嚙小蜂CcOBP3的結(jié)構(gòu)模型.

白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP3的三維結(jié)構(gòu)有6個α螺旋，分別為Arg32-Thr51（α1）、Leu54-Asn63（α2）、Pro69-Leu81（α3）、Ala93-Ile102（α4）、Ile108-Val116（α5）、Pro128-Glu142（α6），如圖2所示.

圖2 白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白Cc OBP3的3維結(jié)構(gòu)Fig.2 3D structure of odorant binding protein Cc OBP3 of Chouioia cunea

CcOBP3拉式構(gòu)象的分析結(jié)果如圖3所示.由圖3可以看出，97.5%的CcOBP3氨基酸殘基落在最佳區(qū)域（藍色區(qū)域），1.7%的氨基酸殘基落在較合理區(qū)域（紫色區(qū)域），只有0.8%的氨基酸殘基落在不允許區(qū)域（白色）.有97.5%的CcOBP3氨基酸殘基落在最佳區(qū)域，大于90%，說明該蛋白模型較為合理.

圖3 Cc OBP3 3維模型的拉氏構(gòu)象評價Fig.3 Rational evaluation of the established 3D model of Cc OBP3 by Ramachandran plot

利用PROSA（https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php）對同源建模所得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型進行能量評價，評價結(jié)果如圖4所示.由圖4可以看出，Z-score值為-5.82，一般Z-score為負值就表示此蛋白的結(jié)構(gòu)模型是合理的.經(jīng)2種方法對CcOBP3模型進行評價，確認CcOBP3經(jīng)同源建模獲得的模型構(gòu)象合理，可以用于后續(xù)的分子對接.

圖4 Cc OBP3蛋白整體模型質(zhì)量Fig.4 Overall quality of Cc OBP3 model

2.2.2CcOBP3與小分子物質(zhì)的對接結(jié)果

用maestro10.2軟件計算CcOBP3與8種小分子物質(zhì)的結(jié)合能量.對接完成后，得到各個化合物與CcOBP3結(jié)合的結(jié)合常數(shù)，如表1所示.結(jié)合常數(shù)的絕對值越大，說明CcOBP3與該化合物結(jié)合所需的自由能越少.根據(jù)分子對接結(jié)果，3-蒈烯與CcOBP3的結(jié)合特性最大，美國白蛾的揮發(fā)物成分鄰苯二甲酸二甲酯和正戊醛也與CcOBP3有較強的結(jié)合特性.

表1 可能與Cc OBP3結(jié)合的化合物及結(jié)合常數(shù)Tab.1 Compounds and binding constants that may bind Cc OBP3

CcOBP3與3-蒈烯主要通過范德華力等進行結(jié)合，具體結(jié)合過程如圖5所示.CcOBP3的Met-96、Val-139、Phe-148和Phe149與3-蒈烯通過碳磷鍵結(jié)合；Pro-150、Phe-135、Met-79和Ile-100與3-蒈烯通過碳碳鍵結(jié)合；Met-82、Thr-84、Gln-99、Met-103、Val-104和Thr136通過范德華力結(jié)合.

圖5 Cc OBP3與小分子化合物對接結(jié)果Fig.5 Docking results of Cc OBP3 with small molecule compound

3 討論與結(jié)論

CcOBP3是在白蛾周氏嚙小蜂觸角中大量表達的一個氣味結(jié)合蛋白.本課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得了CcOBP3的cDNA全序列，用Bio Edit、EXPASY平臺中的SignalP3.0 Serve和HMMTop軟件分析了CcOBP3的堿基序列，結(jié)果表明，CcOBP3具有昆蟲氣味結(jié)合蛋白的典型特征，即相對分子質(zhì)量小、有6個保守的半胱氨酸位點，在N端有信號肽.

分子對接技術(shù)是基于計算機模擬技術(shù)，通過構(gòu)建蛋白和小分子化合物的三維構(gòu)象，將小分子匹配到蛋白質(zhì)的結(jié)合位點上進而評估結(jié)合力強弱的一種生物分析技術(shù).利用分子對接技術(shù)，針對白蛾周氏嚙小蜂的CcOBP3在美國白蛾蛹等的揮發(fā)物中篩選能夠與之結(jié)合的物質(zhì)，最終得到與CcOBP3特異結(jié)合的化合物，明確CcOBP3的結(jié)合特性.利用Swiss-Model在線搜索建模，結(jié)果表明，意大利蜜蜂的氣味結(jié)合蛋白OBP5（ID:3r72.1）與白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP3的相似度最高.Rama-chandran和PROSA能量評價結(jié)果均表明模型構(gòu)象合理.分子對接的結(jié)果表明，白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP3可能與3-蒈烯結(jié)合.3-蒈烯是精油中單萜烯的主要組分，具有強烈的松木樣香.據(jù)報道，3-蒈烯對一些昆蟲具有吸引作用.例如，3-蒈烯對紅脂大小蠹具有一定的吸引作用[25]；3-蒈烯對花絨寄甲也有明顯的引誘作用[26].因此推測CcOBP3的功能與引誘作用相關(guān).

本研究通過軟件分析和分子對接技術(shù)對白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP3進行了多角度的預測分析，為CcOBP3的后續(xù)研究和進一步探明白蛾周氏嚙小蜂的嗅覺機制積累數(shù)據(jù).