趙婉，王艷峰，史振平, *，解萬翠, *，葛曉萍，羅欽

1. 青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院（青島 266042）；2. 山東省生物化學(xué)工程重點實驗室（青島 266042）

水產(chǎn)品中的高值產(chǎn)品經(jīng)簡單處理后直接進入市場，高值產(chǎn)品的生產(chǎn)加工過程中會產(chǎn)生大量的下腳料，如魚頭、魚皮、魚鰭、魚尾、魚骨、魚內(nèi)臟、蝦頭、蝦殼、蟹殼、貝類及殘留肉，其質(zhì)量占原料的40%～55%。另外，在捕獲或養(yǎng)殖所得的水產(chǎn)品中還包括一些未經(jīng)處理的低值水產(chǎn)品如小魚小蝦。這些低值水產(chǎn)品和水產(chǎn)品加工下腳料如果被直接丟棄，不僅資源浪費，而且會污染環(huán)境。而這些副產(chǎn)品中不僅含有大量的蛋白質(zhì)，且含有豐富的磷脂、礦物質(zhì)及甲殼素等其他生物活性物質(zhì)[1]。以低值水產(chǎn)品和高值水產(chǎn)品下腳料發(fā)酵而成的產(chǎn)品稱為水產(chǎn)發(fā)酵制品，如海鮮醬油、魚露、魚醬、魚子醬、蝦醬、蟹醬等因其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及獨特的海鮮風(fēng)味而成為我國沿海和東南亞地區(qū)常用的調(diào)味料。水產(chǎn)品發(fā)酵過程中，微生物發(fā)揮至關(guān)重要的作用。與此同時進行的另一過程是水產(chǎn)品的腐敗。水產(chǎn)品在捕獲時體內(nèi)已經(jīng)存在多種微生物，這些微生物來自原料本身或與水產(chǎn)品生長相關(guān)的環(huán)境[2]。水產(chǎn)品中一般都富含易降解蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)易被微生物降解產(chǎn)生游離氨基酸，具有氨基酸脫羧酶活性的微生物使游離氨基酸脫羧后生成相應(yīng)的生物胺（Biogenic amine，BAs）。高含量生物胺對人體的危害極大。且此問題尚未引起相關(guān)部門和行業(yè)的足夠重視。課題組長期從事蝦醬中的風(fēng)味物質(zhì)、發(fā)酵過程中的微生物及生物胺的去除研究，在前期研究的過程中積累了有關(guān)水產(chǎn)發(fā)酵制品生物胺的相關(guān)理論知識，通過對水產(chǎn)發(fā)酵制品中生物胺的存在、產(chǎn)生、檢測及控制理論的闡述，能夠加深對該領(lǐng)域的理解，并為后續(xù)的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 水產(chǎn)發(fā)酵制品中的生物胺

生物胺是一類具有生物學(xué)活性、含氨基的低分子量有機化合物的總稱。根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為三類：脂肪族生物胺如腐胺、尸胺、精胺和亞精胺；芳香族生物胺如酪胺和苯乙胺；雜環(huán)生物胺如組胺和色胺。一般來說，新鮮水產(chǎn)品中生物胺含量很低；而在儲存或加工過程中，它們的濃度會受到影響[3]。目前研究顯示發(fā)酵水產(chǎn)品中的生物胺主要包括組胺、色胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、亞精胺、酪胺和精胺8類，組胺和酪胺的含量顯著高于其他種類的生物胺[4]。課題組利用新鮮蝦頭在實驗室條件的發(fā)酵產(chǎn)物中檢測發(fā)組胺的含量高達120.7 mg/kg。人體內(nèi)存在微量的內(nèi)源性生物胺，且對機體的生理活動具有重要意義，在參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[5]、調(diào)節(jié)DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成[6]、調(diào)節(jié)血壓和血糖濃度以及抗氧化方面[7]均顯示了重要作用。但當(dāng)攝入大量外源性生物胺時會對人體產(chǎn)生毒理效應(yīng)，如頭痛、心悸、水腫、嘔吐、腹瀉等，甚至危及生命[8]。生物胺除了自身產(chǎn)生毒性以外，某些生物胺可與亞硝酸鹽反應(yīng)生成致癌物亞硝胺、亞硝基吡咯烷、亞硝基哌啶等[9]。目前，國際上對食品中生物胺的安全限量尚未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各個國家或組織根據(jù)各自的法律和食品狀況對不同食品中生物胺的含量做出規(guī)定。但到目前為止，我國GB 10133—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)調(diào)味品》中尚無關(guān)于生物胺的具體限量要求。

在水產(chǎn)品發(fā)酵過程產(chǎn)生的各種生物胺中，組胺對人類健康的影響最大[10]。組胺通過與細胞膜上的兩類受體作用而發(fā)揮毒性：通常會導(dǎo)致輕微的疾病與各種各樣的癥狀，包括皮疹、蕁麻疹、惡心、嘔吐、腹瀉、潮紅、刺痛、皮膚發(fā)癢。癥狀的嚴(yán)重程度可能與組胺攝入量和個人對組胺的敏感性有很大的不同[11]。酪胺可促進末梢血管收縮，刺激心律加快，增強呼吸作用，增加血糖濃度，消除神經(jīng)系統(tǒng)中的去甲腎上腺素，引發(fā)偏頭疼；酪胺還是動物體內(nèi)的主要致突變前體物質(zhì)[12]。腐胺和尸胺對人類沒有任何不良的直接健康威脅，而是通過抑制組胺代謝酶如單胺或二胺氧化酶和組胺甲基轉(zhuǎn)移酶的活性增強組織胺和酪胺的毒性效應(yīng)。另外，食品中的腐胺和尸胺與亞硝酸反應(yīng)形成雜環(huán)致癌的亞硝胺，后者是人類已知的最強致癌劑[13]。其他生物胺如精胺、亞精胺、可能與亞硝酸鹽反應(yīng)形成致癌的亞硝胺、苯乙胺也可增強組胺毒性[14]。

2 水產(chǎn)發(fā)酵制品中生物胺的產(chǎn)生

雖然外源生物胺的產(chǎn)生方式有氨基酸脫羧作用和酮或醛類物質(zhì)的胺化或轉(zhuǎn)胺作用兩條途徑，在發(fā)酵水產(chǎn)品中生物胺主要是通過微生物脫羧酶催化氨基酸的脫羧而生成的[15]。所以在水產(chǎn)品發(fā)酵過程中，游離氨基酸、具有氨基酸脫羧酶活性的微生物以及微生物適宜生長的環(huán)境對生物胺的產(chǎn)生和積累影響顯著。因此水產(chǎn)發(fā)酵制品中生物胺的種類和含量主要取決于水產(chǎn)品原料中自身所含氨基酸的組成，例如青皮紅肉類魚金槍魚、鯖魚和鮐魚等鯖科魚類由于含有豐富組氨酸容易產(chǎn)生組胺，因此組胺中毒又叫鯖科魚類中毒。而白肉類魚中腐胺和尸胺含量較高。

除某些水產(chǎn)品原料中天然帶有少量生物胺外，水產(chǎn)品發(fā)酵過程中生物胺的形成以氨基酸脫羧為主。且上述途徑需滿足要3個條件：充足的組胺前體物質(zhì)氨基酸、具有氨基酸脫羧酶活性的微生物以及用于組氨酸與生物胺胺在細胞內(nèi)外輸送的轉(zhuǎn)運蛋白。發(fā)酵水產(chǎn)品中生物胺的合成過程大致如下：游離氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)運蛋白從細胞外運送至細胞內(nèi)后，由氨基酸脫羧酶催化脫去羧基，生成相應(yīng)的生物胺，生成的生物胺再由轉(zhuǎn)運蛋白輸送到細胞外。生物胺胺的前體物質(zhì)是游離氨基酸，富含游離氨基酸的水產(chǎn)品原料在發(fā)酵過程中特別容易產(chǎn)生和積累生物胺。生物胺合成過程中的另一個重要參與者是位于細胞膜內(nèi)的逆向轉(zhuǎn)運蛋白，其負(fù)責(zé)將氨基酸運輸?shù)桨麅?nèi)，并將脫羧后的產(chǎn)物生物胺分泌到胞外。研究發(fā)現(xiàn)在組胺產(chǎn)生過程中由轉(zhuǎn)運蛋白參與的攝取底物和分泌產(chǎn)物是一個偶聯(lián)的過程，即氨基酸由胞外進入到胞內(nèi)和相應(yīng)的生物胺分泌到胞內(nèi)是同時進行的[16]。在酪氨酸的脫羧途徑中，轉(zhuǎn)運蛋白可同時促進酪氨酸-酪氨酸和酪氨酸-酪胺的交換[17]。具有氨基酸脫羧活性的微生物在組胺產(chǎn)生過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，因為生物胺生成途徑的關(guān)鍵酶氨基酸脫羧酶是由生物胺產(chǎn)生菌合成分泌的。根據(jù)目前的報道具有產(chǎn)生物胺能力的微生物主要有：腸桿菌科（Enterobacteri aceae）、乳桿菌屬（Lactobacilli）、假單胞菌屬（Pseudomonads）以及腸球菌（Enterococci）等[18]。組氨酸脫羧酶（Histidine decarboxylase，HDC）可以分為兩類，分別以磷酸吡哆醛和共價的丙酮酰為輔基[19]。而目前僅發(fā)現(xiàn)以磷酸吡哆醛為輔因子的酪氨酸脫羧酶。

3 水產(chǎn)發(fā)酵制品中生物胺的檢測

鑒于目前政府和公眾對食品安全的高度關(guān)注，發(fā)展先進的檢測方法對發(fā)酵水產(chǎn)品中生物胺進行檢測，及時發(fā)現(xiàn)食品中的不安全因素，是保障消費者健康的重要前提之一。因此，可靠、快速和準(zhǔn)確的生物胺檢測方法非常重要。

生物胺檢測手段最常用的方法為高效液相色譜（HPLC），該方法快速、靈敏、重現(xiàn)性好，但是復(fù)雜耗時、儀器昂貴、不便攜[20]。其他的檢測方法包括薄層色譜、氣相色譜法以及酶聯(lián)免疫法（ELISA）。上述方法均有效，但是也有各自的缺點，如費時、敏感性低，而且不適合常規(guī)檢測。企業(yè)一般采用免疫試劑盒區(qū)分組胺含量大于或小于50 mg/L的海產(chǎn)品，該方法只是定性方法，不能定量[21]。毛細管電泳作為一種高效分離分析技術(shù)，是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，通過樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)的一類液相分離技術(shù)，因其進樣量小、分離模式多、分析對象廣等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域；電化學(xué)發(fā)光分析法不用外加光源，因具有較低的背景信號而使被分析物的檢出限低，線性范圍寬，可獲得較高的靈敏[22]。因此，有研究者將這兩種方法結(jié)合一起，可以達到高效、快速、樣品消耗少、操作簡單、成本低的效果。生物胺沒有天然的吸收和熒光，但是使用聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)32+]可以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。而且有多種措施可以提高電化學(xué)發(fā)光的靈敏度。國內(nèi)已有數(shù)個課題組利用毛細管電泳-電化學(xué)發(fā)光法測定不同水產(chǎn)品中生物胺類的報道，如：青蛾、花蛤、海瓜子中組胺和亞精胺的測定[23]；魚露中苯乙胺的測定[24]；鯧魚中的色胺[25]。除此之外，分子生物學(xué)的發(fā)展使得以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的方法用于生物胺的檢測成為可能。基于微生物中氨基酸脫羧酶基因的保守性而設(shè)計引物，根據(jù)擴增片段的結(jié)果判定待測樣品中是否含有某種氨基酸脫羧酶，從而推測生物胺產(chǎn)生菌的存在與否。如使用多重PCR同時檢測多種脫羧酶基因[26]。

4 水產(chǎn)發(fā)酵制品中生物胺的控制

隨著公眾和國家對食品安全的重視程度和要求越來越高，如何有效控制發(fā)酵水產(chǎn)品中的生物胺迫在眉睫。從源頭上來看，發(fā)酵水產(chǎn)品中生物胺產(chǎn)生的主要影響因素包括食品原材料的狀況、微生物的污染以及貯藏條件；在這些因素中，微生物的作用是最主要的。目前，為了預(yù)防生物胺胺的產(chǎn)生和積累，研究了各種方法如調(diào)整貯藏條件、輻照、高靜水壓、食品添加劑和防腐劑，以及負(fù)胺發(fā)酵劑的使用等。上述方法主要通過抑制生物胺產(chǎn)生菌的生長以達到抑制生物胺產(chǎn)生的目的，如降低溫度可以有效抑制生物胺產(chǎn)生菌的生長和繁殖；這些方法能夠在一定程度上降低生物胺的含量，但也存在局限性，如有些微生物在低溫下也能產(chǎn)生生物胺。輻照也是一種有效的降解組胺分子的方法，但其主要缺點是產(chǎn)生自由基化合物的潛在健康危害[27]。而且上述方法均不能消除已經(jīng)產(chǎn)生的生物胺。一旦生物胺在食品中累積，很難避免中毒，因為其結(jié)構(gòu)對熱和低溫非常穩(wěn)定[28]。如何清除發(fā)酵過程中已經(jīng)產(chǎn)生的生物胺成為研究者關(guān)注的另一熱點問題。

研究表明，水產(chǎn)品中除了含有合成并分泌生物胺脫羧酶從而生成生物胺的微生物之外，還含有能產(chǎn)生某種生物胺氧化酶或生物胺脫氫酶等酶類，從而能降解食品中的生物胺的微生物[29]。Renata等[30]對各種發(fā)酵食品中菌株的生物胺代謝過程進行研究，證實食品發(fā)酵過程中產(chǎn)生物胺的菌株并不具備降解生物胺的能力。據(jù)此，水產(chǎn)品中生物胺的消長應(yīng)是由不同微生物引起的。前期在多種發(fā)酵食品中研究結(jié)果認(rèn)為，在食品發(fā)酵初期，原材料中游離氨基酸在細菌氨基酸脫羧酶的作用下，分解成生物胺。而隨著發(fā)酵的進行，鹽分逐漸滲入機體，并分布均勻，逐漸升高的鹽濃度和原材料自身pH的變化，抑制了生物胺產(chǎn)生菌的生長，而生物胺分解酶的細菌卻增加，從而使得生物胺含量降低。隨著生物胺分解酶的細菌的生長，兩種細菌達到了一種平衡，生物胺含量趨于穩(wěn)定[29]。課題組前期的研究表明在發(fā)酵過程中蝦醬中組胺含量的變化規(guī)律是：短期內(nèi)（0～2 d）組胺含量快速上升，隨之組胺含量增速放緩（2～4 d），之后一直到發(fā)酵成熟，蝦醬組胺含量達到最高值[31]。在此理論指導(dǎo)之下，首先從腌制水產(chǎn)品中分離到1株產(chǎn)組胺氧化酶的嗜鹽古細菌（Natrinema gari BCC 24369）[32]；之后陸續(xù)在香腸、奶酪、葡萄酒、魚露等各種發(fā)酵食品中分離到具有降解組胺能力的微生物菌株。國內(nèi)多位學(xué)者分別從魚露、鯖魚、咸魚中分離到生物胺降解菌進行過研究[33-36]。對組胺降解酶的進一步研究表明，組胺氧化酶在水和氧的存在下可將組胺轉(zhuǎn)化成咪唑乙醛、氨和過氧化氫[37]。組胺脫氫酶使組胺脫氨生成乙醛和氨，但不生成過氧化氫[4]。但是組胺脫氫酶去除組胺的效果并不理想[38]。而且，相對于分離獲得的眾多產(chǎn)生組胺氧化酶的菌株，組胺脫氫酶及組胺脫氫酶產(chǎn)生菌株的分離研究也較少。因此，絕大多數(shù)的研究集中于組胺氧化酶及產(chǎn)生菌株。除了從食品基質(zhì)中分離獲得的菌株之外，也有學(xué)者將具有組胺氧化酶活性的已有菌株作為發(fā)酵劑添加到食品中，如亞麻短桿菌（Brevibacterium linens）可減少奶酪中組胺含量[39]；沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）[40]、金黃色葡萄球菌FS19和解淀粉芽孢桿菌[41]、木糖葡萄糖球菌（Staphylococcus xylosus）[42]也使魚露中組胺含量減少；香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）可降解紅酒中的組胺[43]。因此，在發(fā)酵水產(chǎn)品中可利用微生物的生物胺降解酶來降低其中生物胺的含量，該方法可以消除已經(jīng)生成的生物胺，而且利用微生物來控制水產(chǎn)品中的生物胺含量，具有生物反應(yīng)的一般優(yōu)點，如作用條件溫和、反應(yīng)迅速、安全可靠、節(jié)約能源等。

5 結(jié)語

由于水產(chǎn)發(fā)酵制品所擁有的龐大的消費人群和廣闊的市場前景，水產(chǎn)發(fā)酵制品的安全性一直受到研究者的關(guān)注。生物胺對水產(chǎn)發(fā)酵制品的安全性影響極大，因此了解水產(chǎn)品發(fā)酵過程中生物胺的產(chǎn)生、含量的檢測從而最終高效安全消除生物胺的研究具有重要意義。前期的研究已經(jīng)對該過程取得了長足的進展，然而其中也有許多未解之謎，例如水產(chǎn)品發(fā)酵過程中與生物胺含量相關(guān)的微生物菌落結(jié)構(gòu)如何發(fā)生變化，或者說微生物的群落結(jié)構(gòu)變化如何影響生物胺的含量變化？生物胺產(chǎn)生菌和降解菌之間的此消彼長如何調(diào)控？隨著后續(xù)研究的進行，水產(chǎn)品發(fā)酵過程生物胺的生成、累積與消減機制將逐步被揭示。