周明敏 劉育 熊亮 權(quán)大君 何燕 王晞 唐艷紅 黃鶴 黃從新

心臟交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活與急性心肌梗死(AMI)后室性心律失常(VAs)發(fā)生密切相關(guān)[1]。抑制心臟交感神經(jīng)過度激活的神經(jīng)再平衡策略已被證明可減少VAs和心臟性猝死[2]。既往研究表明，心臟交感傳入反射(cardiac sympathetic afferent reflex, CSAR)是一種由心臟傳入信號激活的交感神經(jīng)興奮性反射，參與AMI、心力衰竭和高血壓等疾病的交感神經(jīng)異常激活[3-4]。筆者探討選擇性去心臟交感傳入神經(jīng)(selective cardiac sympathetic afferent denervation，SCSAD)對AMI后心臟自主神經(jīng)功能、電生理學特性以及VAs發(fā)生的影響，以期為AMI后惡性室性心律失常的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康成年雄性雜種犬24只(體重18～24 kg)，由武漢大學人民醫(yī)院動物中心提供。采用隨機數(shù)字表法將24只犬隨機分為3組：對照組(n=8)、AMI組(n=8)和SCSAD組(n=8)。實驗用犬均通過3%戊巴比妥鈉麻醉，氣管插管正壓機械通氣(MAO01746，美國霍利斯頓哈佛儀器)，持續(xù)監(jiān)測肢體導聯(lián)心電圖(ECG)。維持劑量為戊巴比妥鈉2 mg·kg-1·h-1并通過角膜反射、肌張力和皮膚夾捏反射評估麻醉深度。分離右側(cè)股動脈，置入鞘管，連接壓力換能器持續(xù)監(jiān)測動脈血壓，分離左側(cè)股靜脈建立靜脈通路持續(xù)滴注生理鹽水(50～80 ml/h)。左側(cè)第四肋間開胸，剪開心包縫制心包吊橋，充分暴露左心。通過加熱墊維持動物體溫為(36.5±1.5)℃。所有心電信號和血壓信號均通過Lead-7000多導電生理儀系統(tǒng)(四川錦江電子公司)實時采集監(jiān)測。該研究通過武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2SCSAD與AMI模型的建立 SCSAD組通過心外膜給予5 ml 50 μg/ml吐溫生理鹽水混合液為溶劑的樹膠脂毒素(Resiniferatoxin，RTX)(美國Sigma公司)，縫合心包膜確保藥物和/或溶劑與心外膜的充分接觸并減少揮發(fā)。對照組和AMI組犬心外膜涂抹5ml不含RTX的溶劑。AMI組(溶劑涂抹后30 min)和SCSAD組(RTX干預后30 min)通過分離實驗犬冠狀動脈(簡稱冠脈)左前降支并于第一對角支以下結(jié)扎的方式建立AMI模型。觀察ECG急性ST段抬高和T波改變來確認AMI模型建立成功。對照組只分離穿線，不結(jié)扎冠脈。

1.3心率變異性(HRV)分析 AMI組與SCSAD組于結(jié)扎冠脈后15 min檢測HRV，對照組于相應時間檢測。使用PowerLab 多導生理記錄儀(澳大利亞ADInstruments公司)采集心電數(shù)據(jù)并使用配套的LabChart 8.1軟件分析5 min ECG記錄條帶的HRV功率譜，分析以下變量：高頻(HF)成分(0.15～0.40Hz)和低頻(LF)成分(0.04～0.15Hz)以及LF/HF[5]。

1.4VAs的觀察 由Lead-7000多導電生理儀系統(tǒng)持續(xù)記錄AMI組與SCSAD組結(jié)扎后1 h ECG，對照組記錄分離冠脈后1 h ECG。分析VAs發(fā)生情況：室性早搏(簡稱室早)和室性心動過速(簡稱室速)發(fā)生次數(shù)，室速持續(xù)時間和心室顫動(簡稱室顫)發(fā)生率。

1.5血清去甲腎上腺素(NE)水平檢測 AMI組與SCSAD組在結(jié)扎冠脈后1 h于頸外靜脈采血，對照組在相應時間采血。采血后以3 000轉(zhuǎn)/分鐘離心15 min，取上清液于-80℃保存。使用犬NE酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(H096，南京建成生物科技有限公司)測定血清NE水平。

1.6心臟電生理指標的檢測 將多極標測電極縫于左心室游離壁，記錄結(jié)扎冠脈后60 min缺血區(qū)和非缺血區(qū)(對照組與相應時間記錄心尖部、心底部)的局部電圖，通過S1S2程控期前刺激分別測量這些部位的有效不應期(ERP)。由Lead-7000發(fā)放期前程序電刺激，由連續(xù)8個S1S1刺激(周長為300ms)外加1個S2刺激組成，S1S2配對間期從250 ms開始反掃，以10 ms遞減，當S2不能奪獲心室時，從上一個S1S2配對間期起始以2 ms遞減，直至不能奪獲心室。ERP定義為未能奪獲心室的最長S1S2配對間期。將自制刺激電極縫置于左心耳，采用300 ms固定周長起搏，應用自制Ag-AgCl電極于結(jié)扎冠脈后1 h記錄缺血區(qū)和非缺血區(qū)(對照組與相應時間記錄心尖部、心底部)的單相動作電位(MAP)，計算MAP復極90%的時程(MAPD90)，并采用S1S1動態(tài)起搏法測定缺血區(qū)(對照組檢測心尖部)動作電位時程(APD)電交替出現(xiàn)的最大起搏周長[6]。相鄰MAPD90相差>5%并交替出現(xiàn)10次以上定義為APD電交替。

1.7左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)(LSG)功能評價 心臟電生理指標檢測完成后，于左側(cè)第2肋間打開胸腔，初步定位LSG后將連接于Grass-S88刺激儀的一根直徑0.1 mm銀絲插入LSG，在LSG不同部位發(fā)放10 V的高頻電刺激(頻率20 Hz，脈寬0.1 ms)30 s，將刺激時血壓升高最明顯的部位定義為血壓變化最大的位點，在此刺激位點固定銀絲，測定不同強度電壓刺激(從10 V開始，以10 V逐步遞增直至70 V，刺激持續(xù)時間30 s)LSG引起的最大收縮壓變化百分比(MSBP%)，以此評價LSG功能。

1.8LSG蛋白表達水平的檢測 實驗結(jié)束時，取各組新鮮LSG組織并存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩肳estern blot分析LSG中c-fos和神經(jīng)生長因子(NGF)的表達水平。相應的一抗分別是抗c-fos(ab156802，Abcam公司)和抗NGF(bs-10806R，Bioss公司)。以內(nèi)參GAPDH條帶光密度值作為標準,計算c-fos和NGF蛋白表達的相對量。

1.9統(tǒng)計學分析 計量資料均采用均數(shù)±標準差表示，3組間比較采用單因素方差分析以及Bonferroni或Tamhane′s T2的事后檢驗；等級資料使用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)M (QL～QU) ]來表示, APD電交替起搏周長的組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗以及Dunn-Bonferroni事后檢驗；計數(shù)資料以分數(shù)表示，室顫發(fā)生率的組間比較采用Fisher確切概率法。采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

AMI組5只,SCSAD組1只死于冠脈結(jié)扎后的室顫發(fā)作(此6只犬僅納入心室顫動發(fā)生率)，其余犬均完成所有實驗。

2.1三組HRV的比較 與對照組比較，AMI組LF和LF/HF顯著增加(P<0.05)。與AMI組比較，SCSAD組LF和LF/HF明顯降低(P<0.05)。與對照組比較，SCSAD組LF亦降低(P<0.05)。見表1。

2.2三組VAs的發(fā)生情況比較 與對照組比較，AMI組室早和室速發(fā)作次數(shù)增多，室速發(fā)作的平均持續(xù)時間延長，室顫發(fā)生率增加(P<0.05)。SCSAD組室早發(fā)作次數(shù)較對照組增多(P<0.05)，而室速發(fā)作次數(shù)，室速發(fā)作的平均持續(xù)時間和室顫發(fā)生率兩者均無差異(P>0.05)。與AMI組比較，SCSAD組室早和室速發(fā)作次數(shù)明顯減少、室速發(fā)作的平均持續(xù)時間明顯縮短(P<0.05)。見表2。

表1 三組犬HRV和血清NE水平的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與AMI組比較，△P<0.05

表2 三組犬VAs發(fā)生情況的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與AMI組比較，△P<0.05

2.3三組血清NE水平的比較 相比對照組，AMI組和SCSAD組血清NE水平升高(P<0.05)，而SCSAD組較AMI組低(P<0.05)。見表1。

2.4三組電生理指標比較 與對照組相比，AMI組左心室缺血區(qū)ERP和MAPD90都顯著縮短，APD電交替起搏周長顯著延長(P<0.05)，而SCSAD組較AMI組ERP和MAPD90延長，APD電交替起搏周長縮短(P<0.05)。與對照組相比，SCSAD組ERP延長(P<0.05)，MAPD90和APD電交替起搏周長二者無差異(P>0.05)。此外，與AMI組相比，SCSAD組左心室非缺血區(qū)ERP和MAPD90顯著延長(P<0.05)。見圖1和表3。

A: 三組犬MAPD90示意圖；B～D: 三組犬APD電交替示意圖。PCL= APD電交替起搏周長

組別nERP 缺血區(qū) 非缺血區(qū) MAPD90 缺血區(qū) 非缺血區(qū) APD電交替起搏周長對照組8154.3±7.1155.5±8.3164.6±6.4 164.4±12.7180.0 (172.5～180.0)AMI組8141.9±9.9? 155.4±12.6 140.6±17.1?161.4±8.8250.0 (242.5～260.0)?SCSAD組8 168.8±10.1?△ 168.4±6.7?△162.4±22.1△178.0±13.6△210.0 (190.0～230.0)△

注：MAPD90=單向動作電位復極90%的時程。與對照組比較，*P<0.05；與AMI組比較，△P<0.05

2.5三組LSG功能的比較 與對照組相比，AMI組LSG在相同電壓(10～ 40 V)刺激后MSBP%顯著升高(P<0.05)，而SCSAD組(20～ 70 V)較AMI組MSBP%減低(P<0.05)。與對照組相比，SCSAD組LSG在相同電壓(50 V和60 V)刺激后MSBP%減低(P<0.05)。見表4。

表4 三組犬LSG刺激引起的MSBP%

注：與對照組比較，*P<0.05；與AMI組比較，△P<0.05

2.6三組LSG蛋白表達比較 與對照組相比，AMI組和SCSAD組c-fos蛋白表達顯著增加(P<0.05)，而SCSAD組較AMI組c-fos蛋白水平降低(P<0.05)。與對照組比較，AMI組NGF沒有顯著性改變(P>0.05)，但SCSAD組NGF表達水平較對照組和AMI組均降低(P<0.05)。見圖2和表5。

NGF=神經(jīng)生長因子

組別nc-fos/GAPDHNGF/GAPDH對照組50.19±0.030.52±0.03AMI組50.68±0.03?0.53±0.06SCSAD組5 0.44±0.04?△ 0.31±0.06?△

注與對照組比較，*P<0.05；與AMI組比較，△P<0.05

3 討論

心臟交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)張力的平衡失調(diào)與心律失常的發(fā)生密切相關(guān)?，F(xiàn)有研究顯示抑制心臟交感神經(jīng)過度激活的神經(jīng)再平衡策略可減少VAs和心臟性猝死，而已知的自主神經(jīng)調(diào)控手段，大多針對心臟交感神經(jīng)傳出通路，對于交感興奮啟動環(huán)節(jié)的心臟交感神經(jīng)傳入通路進行干預的研究相對較少[2, 7]。既往研究發(fā)現(xiàn)激活CSAR需表達瞬時受體電位香草酸亞型1(TRPV1)的心臟交感傳入神經(jīng)纖維，而應用RTX可使表達TRPV1的傳入神經(jīng)元和神經(jīng)纖維快速降解，引起交感傳入纖維脫敏，從而抑制CSAR的激活[8-10]。本研究通過心外膜應用RTX，可以阻斷交感興奮的啟動環(huán)節(jié)達到抑制心臟交感神經(jīng)興奮的目標，減少AMI后交感神經(jīng)的過度激活，對于AMI后惡性VAs的發(fā)生具有抑制作用。

基礎(chǔ)和臨床研究顯示，心肌梗死后交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活是引發(fā)VAs的重要機制[11-13]。AMI后心肌各種代謝產(chǎn)物釋放，通過刺激心臟交感傳入神經(jīng)末梢(主要是TRPV-1陽性的傳入神經(jīng)纖維)來激活CSAR，導致心臟交感傳出神經(jīng)活性升高。本研究的結(jié)果顯示SCSAD可以減少AMI后心臟交感神經(jīng)的過度激活：第一，SCSAD組心外膜RTX預處理顯著抑制AMI后LF(nu)和LF/HF的升高；第二，SCSAD顯著抑制AMI后血清NE水平的升高；第三，SCSAD對AMI后LSG功能有明顯的抑制作用。這些結(jié)果提示CSAR對AMI后心臟交感神經(jīng)的激活起著重要作用，SCSAD可以通過阻斷CSAR中交感興奮的始動環(huán)節(jié)達到抑制心臟交感神經(jīng)興奮的作用。

研究證實自主神經(jīng)系統(tǒng)可以影響心臟電生理，其中激活交感神經(jīng)可縮短心室ERP和APD，而抑制交感神經(jīng)將延長二者[14-15]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)心外膜RTX的應用可以延長AMI后心室ERP和APD,可能與SCSAD后心臟交感神經(jīng)受到抑制相關(guān)。APD電整復假說指出，陡峭的恢復曲線與APD震蕩相關(guān)，易于導致局部傳導阻滯和旋波破裂，促進室顫，而平坦的恢復曲線則具有保護作用[16]。APD電交替可以作為惡性VAs發(fā)生的重要預測因素，電交替的發(fā)生易于導致陡峭的恢復曲線，促進室顫的發(fā)生，而延緩APD電交替的發(fā)生則提示惡性VA發(fā)生風險的降低[17]。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)SCSAD可以縮短AMI后APD電交替起搏周長。增加心室電生理穩(wěn)定性可能是SCSAD抗心律失常發(fā)生的機制之一。

交感神經(jīng)活性的動態(tài)變化與神經(jīng)肽/神經(jīng)遞質(zhì)的變化密切相關(guān)。其中NGF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，決定心臟交感神經(jīng)重構(gòu)的分布和密度[18]。既往研究表明，NGF可以促進LSG重構(gòu)并進一步增加缺血相關(guān)的室性心律失常[19]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SCSAD可以下調(diào)LSG中NGF蛋白的表達情況。c-fos作為一種神經(jīng)元廣泛激活的標志物[20]，筆者發(fā)現(xiàn)SCSAD可以顯著抑制AMI后c-fos蛋白表達。SCSAD抑制LSG神經(jīng)活動和功能可能是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)肽的濃度。

本研究也存在一些局限性。第一，戊巴比妥的麻醉可能會影響自主神經(jīng)系統(tǒng)，但由于整個手術(shù)過程是持續(xù)麻醉，且3組均使用相同的麻醉方式盡可能減少影響；第二，我們僅研究心外膜RTX在急性模型中的作用，對心臟電生理以及神經(jīng)和心臟重塑的長期影響尚需要進一步研究證實。