戴建軍，吳彩鳳，張樹山，孫玲偉，陳亞寧，張德福*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106；3上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201302)

繼1972年Whittingham等[1]首次報(bào)道冷凍小鼠胚胎并獲得存活后代以來，冷凍保存技術(shù)已經(jīng)在超過20個(gè)物種中得到了廣泛的應(yīng)用。然而不同的物種之間，其胚胎或卵母細(xì)胞的抗凍能力不一致。在牛、羊上，其玻璃化冷凍保存已經(jīng)獲得了較大范圍的推廣應(yīng)用，然而豬卵母細(xì)胞和胚胎的冷凍效率至今仍較低[2]，冷凍損傷機(jī)理研究十分迫切。

玻璃化冷凍可對卵母細(xì)胞或胚胎造成超微結(jié)構(gòu)[3]、細(xì)胞器功能[4]和相關(guān)功能基因表達(dá)[5-6]的影響，目前常用電子顯微鏡、共聚焦顯微鏡和RT-PCR等方法進(jìn)行檢測。然而細(xì)胞的生命活動(dòng)是一個(gè)非常復(fù)雜的生理生化過程，很難通過這類常規(guī)檢測對整個(gè)生理生化過程進(jìn)行系統(tǒng)評估?；蚪M表達(dá)譜芯片具有靈敏、高效、平行化、高通量等優(yōu)點(diǎn)，通過篩選特異性表達(dá)基因，可在基因水平上揭示胚胎發(fā)育過程的本質(zhì)，并在胚胎工程研究中被廣泛應(yīng)用。目前將芯片技術(shù)應(yīng)用在胚胎方面的研究物種包括人、鼠、牛、豬和山羊等[7]。

目前，已見小鼠[8]、兔[9]和牛[10]的冷凍胚胎的全基因組表達(dá)譜分析的相關(guān)報(bào)道，但未見豬卵母細(xì)胞冷凍前后全基因組表達(dá)譜分析的相關(guān)研究。本研究擬利用Affymetrix豬的全基因組表達(dá)譜芯片，對玻璃化冷凍前后的豬MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行全基因組表達(dá)譜分析，為深入探究其冷凍損傷機(jī)理奠定基礎(chǔ)，豐富其低溫生物學(xué)的研究內(nèi)容。

1 材料與方法

除特別說明外，本研究所用試劑均購自美國Sigma公司。

1.1 卵母細(xì)胞的采集和體外成熟

于上海五豐公司屠宰場采集初情期前的豬卵巢，置于含500 IUmL雙抗的37 ℃生理鹽水中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用18號針頭注射器收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，沉淀30 min后取沉淀物，在顯微鏡下挑選有3層以上顆粒細(xì)胞且胞質(zhì)均勻的COCs，經(jīng)臺氏液和TCM-199(Gibco，美國)洗滌后置于預(yù)溫平衡的體外成熟培養(yǎng)液(IVM)中培養(yǎng)。體外成熟培養(yǎng)液配方為：TCM-199中分別添加10%(vv)胎牛血清(Gibco，美國)、10%(vv)豬卵泡液(實(shí)驗(yàn)室自制)、10 IUmL孕馬血清促性腺激素(寧波市第三激素制品有限公司，中國)、10 IUmL人絨毛膜促性腺激素(寧波市第三激素制品有限公司，中國)、100 IUmL雙抗、0.1 mgmL的L-半胱氨酸和10 ngmL表皮生長因子。培養(yǎng)條件為：38.5 ℃，5% CO2濃度，飽和濕度。培養(yǎng)44 h后的COCs用0.1%的透明質(zhì)酸酶反復(fù)吹打和消化，在顯微鏡下挑出排出第一極體的卵母細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。同一批次卵母細(xì)胞均隨機(jī)分為新鮮組和OPS玻璃化冷凍組進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 OPS玻璃化冷凍與解凍

在39℃的恒溫操作臺上，MII期卵母細(xì)胞在冷凍保護(hù)劑Ⅰ(TCM199中含7.5%的乙二醇，7.5%二甲基亞砜和10%胎牛血清)中處理5 min，然后轉(zhuǎn)入冷凍保護(hù)劑Ⅱ(TCM199中含17%乙二醇，17%二甲基亞砜，10%胎牛血清和0.4 molL蔗糖)中處理15 s，裝入OPS管，30 s內(nèi)投入液氮保存。解凍時(shí)，分別在0.5 mmolL和0.25 mmolL的蔗糖中平衡5 min，然后移入TCM199中洗2遍，備用。冷凍卵母細(xì)胞在含10% FBS的TCM199中孵育2 h后進(jìn)行收集，每150枚卵母細(xì)胞為一個(gè)重復(fù)樣本，單獨(dú)保存于-80℃冰箱中用于RNA提取。新鮮組則挑取同一批次150枚新鮮成熟卵母細(xì)胞，于-80℃保存后用于RNA提取。

1.3 凍后卵母細(xì)胞存活和孤雌激活發(fā)育能力檢測

1.4 卵母細(xì)胞總RNA的提取

-80℃保存的新鮮和冷凍卵母細(xì)胞用于總RNA提取，采用 RNApreo Pure微量樣品總RNA提取試劑盒(TIANGEN)進(jìn)行RNA提取，用微孔板分光光度計(jì)進(jìn)行RNA濃度檢測，選取A260A280 在1.9—2.1，質(zhì)量濃度大于5 ngμL的RNA溶液用于總RNA的整體擴(kuò)增。整體擴(kuò)增使用TargetAmpTM2-Round aRNA Amplification Kit 2.0試劑盒進(jìn)行。

1.5 芯片雜交、掃描和數(shù)據(jù)分析

新鮮組和OPS玻璃化冷凍組分別取3個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣本分別取100 ng的上述總RNA，利用RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen)純化得到mRNA。目的RNA的準(zhǔn)備和芯片雜交、掃描和初步分析處理參照GeneChip?3’ IVT Expres Kits的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。GeneChip?Porcine Genome Array來源于Affymetrix公司。

采用Affymetrix 公司提供的Expression Console軟件進(jìn)行Robust Multichip Analysis(RMA)分析，根據(jù)樣品分組，進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)ANOVA比對分析，得到組間大于2倍差異表達(dá)的基因，篩選出新鮮組和OPS玻璃化冷凍組差異表達(dá)基因。

對差異表達(dá)基因進(jìn)行顯著性富集分析(Gene ontology，GO)和KEGG Pathway分析。

1.6 部分差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

冷凍和新鮮卵母細(xì)胞經(jīng)RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)在代表性基因中隨機(jī)選擇3個(gè)上調(diào)和3個(gè)下調(diào)表達(dá)基因(激酶和轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)基因MAP3K7，細(xì)胞骨架相關(guān)基因ARPC2和MYL6，脂多糖結(jié)合蛋白相關(guān)基因LBP和線粒體功能相關(guān)基因COX6C、POLG)進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。引物信息如表1所示。反應(yīng)體系：cDNA 模板2.0 μL、SYBR Premix Ex Taq II 10 μL、Forward Primer 0.8 μL、Reverse Primer 0.8 μL、ROX II 0.4 μL、加RNase-Free ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火34 s(Tm均為55℃)，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，退火處收集熒光。在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上運(yùn)行。冷凍和新鮮卵母細(xì)胞各選擇3個(gè)樣本，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

表1 RT-PCR 引物信息

1.7 生物統(tǒng)計(jì)

qRT-PCR以GAPDH為內(nèi)參基因，新鮮組和冷凍組各基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算比較。卵母細(xì)胞發(fā)育能力采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍對豬MII期卵母細(xì)胞存活和體外發(fā)育能力的影響

玻璃化冷凍對豬MII期卵母細(xì)胞存活率和孤雌發(fā)育能力的影響見表2。OPS玻璃化冷凍后其FDA染色存活率(72.50%)顯著低于新鮮組(98.00%)(P<0.05)。OPS冷凍卵母細(xì)胞解凍后經(jīng)孤雌激活，取得了14.56%的卵裂率和4.85%的囊胚率，顯著低于新鮮組的80.91%和35.45%(P<0.05)。

表2 冷凍對豬卵母細(xì)胞存活和孤雌激活發(fā)育的影響

同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 冷凍卵母細(xì)胞全基因組表達(dá)譜芯片研究

將OPS玻璃化冷凍組數(shù)據(jù)與新鮮卵母細(xì)胞組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，篩選出171個(gè)2倍以上差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因103個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因68個(gè)。部分代表性差異表達(dá)基因見表3。

2.3 部分差異基因的qRT-PCR表達(dá)驗(yàn)證

如圖1所示，與新鮮卵母細(xì)胞相比，MAP3K7 、ARPC2和LBP基因的表達(dá)水平在冷凍卵母細(xì)胞中分別上調(diào)2.98倍、1.92倍和2.65倍，COX6C、POLG和MYL6基因的表達(dá)水平分別下調(diào)5.64倍、3.26倍和4.85倍，所得結(jié)果與基因芯片基本一致。

圖1 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.1 qRT-PCR validation of differentially expressed genes

2.4 芯片結(jié)果的系統(tǒng)聚類分析和主成分分析

如圖2所示,3個(gè)新鮮組樣品和3個(gè)玻璃化冷凍組樣品組內(nèi)相似性較好，而組間的基因表達(dá)具有一定的差異性。

圖2 系統(tǒng)聚類分析和主成分分析Fig.2 Hierarchical clustering analysis and principle component analysis

2.5 冷凍后上調(diào)差異表達(dá)基因的GO分析

卵母細(xì)胞冷凍后上調(diào)差異表達(dá)基因的生物過程(Biological process，BP)、細(xì)胞組成(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)的GO分析結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，上調(diào)表達(dá)基因涉及損傷應(yīng)答、有機(jī)物反應(yīng)、蛋白激酶調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死調(diào)節(jié)等生物過程。同時(shí)還涉及胞外區(qū)、基底質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等細(xì)胞組成調(diào)控和類固醇結(jié)合、酶抑制劑的活性、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合、激素結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能調(diào)控。

圖3 上調(diào)差異表達(dá)基因的GO注釋Fig.3 GO annotation of up-regulated differentially expressed genes

2.6 冷凍后下調(diào)差異表達(dá)基因的GO分析

卵母細(xì)胞冷凍后下調(diào)差異表達(dá)基因的生物過程、細(xì)胞組成和分子功能的GO分析結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，下調(diào)表達(dá)基因涉及RNA拼接，核mRNA拼接，mRNA 代謝，轉(zhuǎn)運(yùn)正向調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖等生物過程。同時(shí)還涉及線粒體脊、線粒體、細(xì)胞器膜、線粒體包膜和剪接體等細(xì)胞組成調(diào)控和核苷酸結(jié)合、FAD結(jié)合、輔酶結(jié)合、固醇轉(zhuǎn)運(yùn)活性、核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性和ATP酶活性等分子功能調(diào)控。

圖4 下調(diào)差異表達(dá)基因的GO注釋Fig.4 GO annotation of down-regulated differentially expressed genes

2.7 冷凍后差異表達(dá)基因的KEGG Pathway分析

豬MII期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后有顯著性差異的KEGG Pathway分析結(jié)果見圖5。差異表達(dá)基因涉及Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、黏著連接和MAPK信號通路等。

圖5 差異表達(dá)基因KEGG Pathway—(-LgP)柱狀圖Fig.5 Histogram of KEGG Pathway—(-LgP)for differentially expressed genes

3 討論

卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育過程是由基因控制的復(fù)雜過程，然冷凍可造成其基因表達(dá)水平的異常變化[5,8]。本研究利用Affymetrix豬商業(yè)化表達(dá)譜芯片對冷凍前后的豬卵母細(xì)胞的全基因組表達(dá)譜進(jìn)行了研究，獲得了已獲注解的2倍以上差異表達(dá)基因171個(gè)，這為今后篩選得到更多的冷凍相關(guān)基因提供了豐富的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

在這些差異表達(dá)基因中，凍后下調(diào)倍數(shù)最高的是SLC25A3基因，達(dá)38.583倍，該基因是編碼Pic基因的重要組成部分，而Pic則是線粒體內(nèi)膜上的一個(gè)重要功能蛋白，在線粒體膜通道孔打開中發(fā)揮重要作用[11]。在文中所列的其他差異表達(dá)基因中，ATP2A2、VDAC2、COX6C、POLG、PPARGC-1等均與線粒體功能密切相關(guān)。研究表明，冷凍可造成豬MII期卵母細(xì)胞線粒體功能的系統(tǒng)性損傷，包括超微結(jié)構(gòu)異常、膜電位下降、ATP水平降低和抗氧化能力減弱等[4]與本研究結(jié)果一致。本研究中上調(diào)倍數(shù)最高的基因?yàn)镹PPC，上調(diào)倍數(shù)為3.64317。該基因在抑制卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂中發(fā)揮重要作用[12]，驗(yàn)證了本研究中凍后發(fā)育能力顯著下降這一結(jié)果。

在上調(diào)差異表達(dá)基因的生物學(xué)過程GO分析中，排名第一的為損傷應(yīng)答(Responese to wounding)。冷凍作為一種強(qiáng)刺激源，使細(xì)胞受到嚴(yán)重的破壞和損傷，從而使細(xì)胞對損傷做出迅速的反應(yīng)，這為日后冷凍損傷的機(jī)理研究提供了新的方向。本研究中凋亡、細(xì)胞程序性死亡和細(xì)胞壞死調(diào)節(jié)也是參與基因上調(diào)表達(dá)的重要生物學(xué)過程。研究表明，在卵母細(xì)胞和胚胎冷凍中，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是發(fā)育能力下降的主要因素之一[13-14]，且死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑共同導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生[15]。此外，有機(jī)物反應(yīng)和蛋白激酶調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程也參與了凍后卵母細(xì)胞的基因調(diào)控，相關(guān)研究值得后續(xù)進(jìn)一步深入。

在上調(diào)基因的細(xì)胞組分分析中，胞外區(qū)、基底質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等參與了其冷凍后上調(diào)基因表達(dá)調(diào)控。冷凍作為一種外源性刺激因子，其首先對細(xì)胞外區(qū)域產(chǎn)生重大影響，因此胞外區(qū)分離和細(xì)胞外間隙的細(xì)胞組分影響排在細(xì)胞組分分析的前列。冷凍能對細(xì)胞質(zhì)膜產(chǎn)生嚴(yán)重破壞，這一點(diǎn)已經(jīng)在眾多的研究中得到了證實(shí)[16]。冷凍還對卵母細(xì)胞的細(xì)胞骨架產(chǎn)生影響[17]，本試驗(yàn)中上調(diào)基因的細(xì)胞組分分析中，有6個(gè)上調(diào)表達(dá)基因參與了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控。

卵母細(xì)胞冷凍后下調(diào)差異表達(dá)基因的生物過程分析中，RNA拼接、核mRNA拼接和mRNA 代謝等參與了冷凍后下調(diào)基因表達(dá)的生物過程調(diào)控。MII期卵母細(xì)只能通過其自身儲備的RNA和mRNA來合成相關(guān)蛋白，其本身并不能轉(zhuǎn)錄RNA，故其RNA豐度對隨后的胚胎發(fā)育有重要作用[18]。本研究芯片結(jié)果表明，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍一方面通過影響卵母細(xì)胞內(nèi)RNA和mRNA的剪接而影響其生物學(xué)過程，另一方面通過干擾其mRNA代謝，降低其自身RNA儲備影響基因表達(dá)。在本研究的下調(diào)基因細(xì)胞組分分析中，與線粒體功能密切的組分占了最主要部分，包括線粒體脊、線粒體、細(xì)胞器膜和線粒體包膜等，說明冷凍對線粒體功能產(chǎn)生了巨大影響。已有研究表明，冷凍會對卵母細(xì)胞的線粒體功能產(chǎn)生破壞[19]，玻璃化冷凍會對豬卵母細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、分布和膜電位產(chǎn)生負(fù)面影響[4]，這些結(jié)果與本研究中下調(diào)功能基因的細(xì)胞組分分析結(jié)果相一致。

在凍后差異表達(dá)基因的KEGG Pathway分析中，Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、黏著連接和MAPK信號通路參與了差異表達(dá)基因的調(diào)控通路。Toll樣受體信號通路和NOD樣受體信號通路在機(jī)體免疫系統(tǒng)[20]和抗感染[21]中發(fā)揮重要作用，冷凍對細(xì)胞的損傷和刺激可能誘導(dǎo)了該信號通路的發(fā)生，相關(guān)研究需進(jìn)一步深入。黏著連接是細(xì)胞中的一個(gè)重要連接方式，是一種有細(xì)胞骨架參與的緊密連接方式，與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)[22]。冷凍中黏著連接上調(diào)信號通路的參與可能與細(xì)胞骨架相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)相關(guān)。MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究證實(shí)，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過程中具有至關(guān)重要的作用[23]。冷凍后，MAPK信號通路調(diào)控參與其中，表明冷凍對卵母細(xì)胞隨后的存活率和發(fā)育能力將產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。

4 結(jié)論

本研究利用豬全基因組表達(dá)譜芯片分析了豬MII期卵母細(xì)胞冷凍前后的基因表達(dá)差異，篩選出了171個(gè)差異表達(dá)基因。聚類分析和KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞損傷應(yīng)答、凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞骨架、mRNA拼接和線粒體功能等多種生物學(xué)過程參與了凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育異常。本研究為進(jìn)一步探究豬卵母細(xì)胞冷凍損傷機(jī)理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。