王義勛 徐小文 祁高富 侯珊珊 許秀環(huán)蔡明乾 朱紅軍 陳京元

(1.湖北省林業(yè)科學(xué)研究院 武漢 430075； 2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 武漢 430070； 3. 武漢市林業(yè)科技推廣站 武漢 430024； 4.?？悼h林業(yè)局 十堰 441600)

松材線蟲病(又稱松樹萎蔫病)是松樹上的一種極具毀滅性的病害，是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的我國目前危害最嚴(yán)重的檢疫性病害之一[1]。敏感型松樹感染松材線蟲后，最快的40多天即可枯死[2]。松材線蟲的寄主高達(dá)數(shù)十種，其蔓延迅速，發(fā)生面積不斷擴(kuò)大，危害程度不斷加重，對(duì)我國的松樹資源、自然景觀和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[3]。近年來，在湖北省境內(nèi)，松材線蟲病大面積發(fā)生，疫情日趨嚴(yán)重，對(duì)我省的松樹資源造成了巨大的威脅。在這種形勢(shì)下，找到新型高效的防控措施成為迫切的需要。松材線蟲的防治對(duì)于控制松材線蟲病起著至關(guān)重要的作用，隨著該病害的日益蔓延，利用高效、低毒、選擇性好的生物防治方法來防控松材線蟲病成為研究的熱門。在前期的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)了10株對(duì)根結(jié)線蟲具有良好防治效果的生防菌，本研究以這10株生防菌為實(shí)驗(yàn)材料，展開了室內(nèi)和林間的殺蟲活性實(shí)驗(yàn)測(cè)定，為松材線蟲病生物防治試劑的選擇擴(kuò)增了范圍，也為尋找潛在的有效生防菌株提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的10株對(duì)根結(jié)線蟲有較好防治效果的生防菌株(菌株編號(hào)分別為A4、A12、A15、A16、A18、B3、B9、B12、D1、D4)。松材線蟲和灰葡萄孢菌均由南京林業(yè)大學(xué)提供。松材線蟲的保存方法參見文獻(xiàn)[4]。

1.2 培養(yǎng)基和抗生素

1.8 % 水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂18 g ，去離子水定容至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌后使用。

M9緩沖液：Na2HPO4·7H2O 5.8 g，KH2PO43.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水定容至1 L，高壓蒸汽滅菌后加入終濃度為0.1 mg/mL MgSO4·7H2O使用。

鏈霉素：溶解0.1 g鏈霉素于足量的蒸餾水中，最后定容至10 mL。以100 mg/mL的終濃度添加于細(xì)胞培養(yǎng)板中，用于抑制雜菌的生長(zhǎng)。

氯霉素：溶解0.02 g膽固醇于足量的無水乙醇中，蒸餾水定容至10 mL。以2 mg/mL的終濃度添加于細(xì)胞培養(yǎng)板中，用于抑制雜菌的生長(zhǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

在超凈工作臺(tái)將培養(yǎng)好的供試菌株分別接種于裝有 250 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床上(37 ℃，180 r/min )振蕩培養(yǎng) 48 h，獲得發(fā)酵液。

1.3.2 提取菌株活性成分

將上述得到的生防菌株發(fā)酵液用等體積石油醚萃取三次，合并萃取物，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到的干燥物用無水乙醇溶解。

1.3.3 線蟲的培養(yǎng)

將灰葡萄孢菌接種到PDA培養(yǎng)平板上，放置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿全皿。在超凈工作臺(tái)中將松材線蟲接種于灰葡萄孢平板上，于25℃培養(yǎng) 10 d。采用貝爾曼漏斗法分離線蟲，10 h后將收集得到的線蟲液在離心機(jī)中離心(4 000 r/min，5 min)去掉雜質(zhì)后，用M9緩沖液稀釋線蟲液，重復(fù)3次，最后收取到線蟲液。

1.3.4 10株生防菌株對(duì)松材線蟲殺蟲活性測(cè)定

將對(duì)根結(jié)線蟲有較好防治效果的10株生防菌(編號(hào)分別為A4、A12、A15、A16、A18、B3、B9、B12、D1、D4)，發(fā)酵48 h后離心，10 000 rpm, 20 min,取上清液，稀釋不同的濃度，包括上清原液、稀釋2倍、稀釋10倍、稀釋50倍等濃度梯度，對(duì)松材線蟲進(jìn)行室內(nèi)防治試驗(yàn)。向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔里依次加入3 μL氯霉素(2 mg/mL)，1 μL鏈霉素(100 mg/mL)，處理組加入200 μL 不同濃度上清液，對(duì)照組加入200 μL M9緩沖液，最后加入30條左右的松材線蟲，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)，24 h后觀察并計(jì)算松材線蟲線蟲致死率。

1.3.5 菌株A4發(fā)酵乙醇抽提物對(duì)松材線蟲LC50值測(cè)定

選取室內(nèi)殺蟲活性最好的A4菌株為試驗(yàn)對(duì)象。先用M9緩沖液將培養(yǎng)好的松材線蟲洗入離心管中制成蟲液，向1.5 mL的離心管中加入0.5 mL 1.8%的水瓊脂，待其凝固后加入1ul松材線蟲液(約30條)，在離心管蓋上放入圓濾紙片，分別向?yàn)V紙片上滴加濃度為0.168 、0.252、0.336、0.418、0.502、0.585、0.669、0.752、0.836 mg/mL的A4發(fā)酵乙醇抽提物各1 μl，以等量無水乙醇為對(duì)照。用封口膜將其密封后，避光放置于20 ℃培養(yǎng)箱，24 h后測(cè)定A4發(fā)酵乙醇抽提物熏蒸殺蟲活性。

1.3.6 菌株A4發(fā)酵乙醇抽提物在林間的殺蟲活性測(cè)定

將菌株A4經(jīng)48 h發(fā)酵后得發(fā)酵液10 L，發(fā)酵液用乙醇抽提后用于林間試驗(yàn)。選擇武漢蔡甸區(qū)和江夏區(qū)2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，共1.6 hm2的松林進(jìn)行松材線蟲病防治試驗(yàn)。蔡甸區(qū)試驗(yàn)地 0.8 hm2，為馬尾松純林，其中防治區(qū)0.5 hm2，對(duì)照區(qū)0.3 hm2；江夏區(qū)試驗(yàn)地0.8 hm2，為馬尾松純林，其中防治區(qū)0.5 hm2，對(duì)照區(qū)0.3 hm2。在2018年5月施藥，10月調(diào)查林間發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)松材線蟲病枯死株數(shù)，計(jì)算防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 10株生防菌株對(duì)松材線蟲殺蟲活性測(cè)定

室內(nèi)殺蟲活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10株生防菌株的發(fā)酵原液對(duì)松材線蟲均有很好的殺蟲活性；當(dāng)將原液稀釋2倍后，菌株A4、A15、B3、B9、D1、D4仍然具有大于50%的殺蟲活性；當(dāng)將原液稀釋10倍后，菌株A4的殺蟲活性依然高于50%(圖1)，此結(jié)果表明菌株A4具有更好的室內(nèi)殺蟲活性。

圖1 10株生防菌不同濃度梯度發(fā)酵液對(duì)松材線蟲殺蟲活性的測(cè)定

2.2 菌株A4發(fā)酵抽提物對(duì)松材線蟲LC50值測(cè)定

菌株A4發(fā)酵乙醇抽提物對(duì)松材線蟲的致死率見表1。由DPS軟件計(jì)算得出回歸方程為y=6.75x+8.61，相關(guān)系數(shù)R2= 0.978，LC50值為0.291 mg/mL。在光學(xué)顯微鏡下觀察松材線蟲的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與正常的活體蟲態(tài)相比，經(jīng)發(fā)酵液處理后的松材線蟲蟲體僵直，體內(nèi)出現(xiàn)異常泡狀物。該實(shí)驗(yàn)表明菌株A4的發(fā)酵液對(duì)松材線蟲的致死中濃度是0.291 mg/mL，能夠作用于松材線蟲，起到殺死蟲體的效果。

表1 菌株A4發(fā)酵抽提物對(duì)松材線蟲LC50值測(cè)定

2.3 菌株A4發(fā)酵抽提物在林間的殺蟲活性測(cè)定

由表2可知，在蔡甸，防治區(qū)的松樹枯死率為3.33%，對(duì)照區(qū)的則為7.00%，與對(duì)照區(qū)相比，防治區(qū)的松樹枯死率下降了52.43%；在江夏，防治區(qū)的松樹枯死率為2.00%，對(duì)照區(qū)的為5.00%，與對(duì)照區(qū)相比，防治區(qū)的松樹枯死率下降了60.00%，該結(jié)果表明，菌株A4的發(fā)酵乙醇抽提物在林間有較好的防治效果，能夠有效降低林間的松樹枯死率，為松材線蟲病林間防治工作提供了數(shù)據(jù)參考。

表2 菌株A4發(fā)酵抽提物對(duì)松材線蟲病防治效果

3 結(jié)論與討論

生物防治由于具有對(duì)環(huán)境友好，不易產(chǎn)生抗藥性和防治效果較好等優(yōu)點(diǎn)，已成為病害防治研究熱點(diǎn)。生物防治在松材線蟲病的定義上是指通過引入能夠捕食線蟲或者產(chǎn)生毒素殺死線蟲或使得線蟲的致病力顯著降低的生物來達(dá)到有效降低病害的手段[5,6,7]。當(dāng)前被用來進(jìn)行植物線蟲防治的生物包括真菌、細(xì)菌、病毒、捕食性線蟲、昆蟲和螨類等[8,9,10]，其中細(xì)菌由于具有易培養(yǎng)、繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn)，在松材線蟲的生物防治中占有重要的地位[7]。據(jù)現(xiàn)有報(bào)導(dǎo)顯示，對(duì)線蟲有拮抗活性的細(xì)菌種類包括有芽孢桿菌類、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌和根際細(xì)菌等[11,12]。

本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象即為10株對(duì)根結(jié)線蟲有較好拮抗作用的生防細(xì)菌，室內(nèi)殺蟲活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這10個(gè)菌株的發(fā)酵原液都具有很好的殺蟲效果，當(dāng)將發(fā)酵液稀釋2倍、10倍后仍然有菌株表現(xiàn)出較好的拮抗活性，其中菌株A4在發(fā)酵液被稀釋10倍后仍然具有大于50%的殺蟲活性，說明該菌株有很好的生防潛力。經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)觀察和16SrDNA測(cè)序鑒定后發(fā)現(xiàn)該菌株為短小芽孢桿菌。芽孢桿菌類細(xì)菌對(duì)松材線蟲具有殺蟲活性的報(bào)導(dǎo)已屢見不鮮，徐華潮等發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌的晶體蛋白對(duì)松材線蟲有很好的殺蟲活性[13]。郝穎等研究表明一株蠟狀芽孢桿菌能夠通過分泌具有熱穩(wěn)定的活性物質(zhì)來殺死線蟲[14]。朱麗梅等篩選到1株解淀粉芽孢桿菌，其發(fā)酵液的殺線蟲活性即使在稀釋10倍后仍然高達(dá)98.5%[15]。牛秋紅等從土壤分離得到的芽孢桿菌NS-3，其培養(yǎng)濾液的殺蟲活性不高，但濾液的蛋白粗提物卻具有很好的殺蟲活性[16]。這些研究結(jié)果表明芽孢桿菌類細(xì)菌在松材線蟲的生物防治方面占有相當(dāng)?shù)谋壤?，同時(shí)不同種類的芽孢桿菌其殺線蟲的作用機(jī)理也有差別，有的活性物質(zhì)存在于發(fā)酵濾液中，有的存在于蛋白粗提物中，表明作用于松材線蟲的有效物質(zhì)可能是芽孢桿菌分泌的毒素或者某些蛋白酶類。在本研究中，將被殺死的線蟲在顯微鏡下觀察其生理結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)蟲體內(nèi)部出現(xiàn)空泡，其頭部、體壁和尾部均有損傷，提示菌株A4的活性物質(zhì)能夠造成線蟲內(nèi)容物的消解，但具體的作用機(jī)理和活性物質(zhì)的種類鑒定還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。

在菌株A4發(fā)酵抽提物的林間防治試驗(yàn)中，與對(duì)照區(qū)相比，防治區(qū)的松樹枯死率明顯降低，表明該活性物質(zhì)在林間性質(zhì)穩(wěn)定，能夠起到較好的防治作用。林間防效通常會(huì)受到林間因子，如溫度、濕度、林分特點(diǎn)等，以及施藥方式、施藥濃度、施藥頻率等因子的影響，而本研究?jī)H初步測(cè)定了其林間防效且防治區(qū)域有限，盡管取得了較好的防治效果，仍需進(jìn)一步優(yōu)化其生產(chǎn)工藝，在推廣運(yùn)用前還需開展更加細(xì)致地林間試驗(yàn)。