聶紅艷，邱艷麗，靳 燕，曹嫣娜，閆 杰，李 杰，王景福，趙 強

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院兒童腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津300060）

T淋巴瘤侵襲轉移蛋白（T-lymphoma invasion and metastasis 1，TIAM1）基因，即 TIAM1 基因，是一種鳥苷酸轉換因子（GEF），為Rho家族中Rac1特異激活劑，參與細胞骨架活動，以及細胞遷移、粘附和侵襲、癌變和轉移等[1]。有文獻表明，TIAM1促進癌細胞的侵襲和轉移，例如：在食管癌[2]，肝癌[3],宮頸癌[4]，甲狀腺癌[5]等疾病中。而在結直腸癌中，有研究者提出其具有抑癌的作用[6]。有學者對106例原發(fā)性神經(jīng)母細胞瘤組織進行二代測序發(fā)現(xiàn)，具有TIAM1基因變異者，其預后更好。認為可將TIAM抑制劑與常規(guī)療法相聯(lián)合，來改善患者預后[7]。然而，Cao等[8]對33例神經(jīng)母細胞瘤（neuroblastoma,NB）組織進行靶向捕獲的二代測序發(fā)現(xiàn)1例TIAM1基因缺失，該患者組織經(jīng)HE染色為NB分化差型。因此，TIAM1是促進NB發(fā)生和轉移還是具有抗癌作用，仍需進一步探索。本研究通過免疫組化的方法檢測NB組織中TIAM1的表達，探討其是否與NB的發(fā)生發(fā)展相關。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2010-2015年就診于我院病理診斷明確、腫瘤標本保存完好、治療規(guī)律，隨訪資料完整的病例61例，其中節(jié)細胞神經(jīng)瘤9例，NB52例。根據(jù)INSS分期標準，NB的例數(shù)為：1期9例，2期6例，3期12例，4期24例，4S期1例。定義1、2及4S期為低分期（低危組）15例，3、4期為高分期（中-高危組）37例。年齡大于18個月者35例，小于18個月者17例；起源于頸、腹部者38例，胸、盆腔者14例；初治時腫瘤大小≤6 cm者26例，＞6 cm者26例；低分化者31例，高分化者21例。采用門診、電話隨訪，統(tǒng)計終點為復發(fā)，死亡或隨訪終點，末次隨訪時間為2017年9月1日，隨訪時間為4～74個月，中位隨訪時間為33個月，截至隨訪結束時，死亡6例。

1.2 免疫組化染色 免疫組化通用試劑盒PV-6000操作說明進行，簡要步驟如下：切片脫蠟水化；枸櫞酸抗原修復；內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10min；滴加TIAM1一抗（abcam），4℃過夜，室溫復溫后，滴加酶標山羊抗小鼠/兔IgG復合物，37℃，20 min；DAB顯色，蘇木素復染、鹽酸酒精返紅、氨水返藍，脫水、透明、封片。

1.3 結果判讀 對上述61例患者石蠟切片進行TIAM1免疫組化染色，至少2名專業(yè)兒童病理科醫(yī)師，采用半定量分級法評分對染色結果做出判斷，根據(jù)呈陽性反應的細胞所占比例和反應強度進行綜合評價。陽性表達表現(xiàn)為棕黃色顆粒。采用雙盲法，用染色強度和同樣物鏡視野下的陽性細胞數(shù)乘積作為評分；染色強度分為四個等級：0分=無色；1分=淺黃色；2分=棕黃色；3分=棕褐色；陽性細胞數(shù)分四個等級為：1分=1%～10%；2分=11%～50%；3分=51%～75%；4分=76%～100%，兩者的乘積作為評分數(shù)值，定義評分小于等于4分為低表達，評分大于4分為高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用Log-rank χ2檢驗進行單因素分析，Kaplan-Meier法分析患者生存率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。“*”代表P＜0.05,“**”代表P＜0.01。

2 結果

2.1 TIAM1在腫瘤組織中的表達 在NB組織中，TIAM1弱表達（評分≤4）16例，TIAM1強表達（評分＞4）36例。而在這9例節(jié)細胞神經(jīng)瘤中8例為高表達，1例為低表達，陽性率為88.9%。TIAM1蛋白主要定位于細胞漿中，但也可表達在細胞核內[6]（圖1），并且其表達與NB分化程度相關（χ2=4.493，P=0.034），分化程度越高的組織其表達越強。TIAM1 與年齡 （χ2=0.243，P=0.622），發(fā)病部位（χ2=0.043，P=0.835），初治時腫瘤大小（χ2=1.444，P=0.229），INSS 分期（χ2=0.843，P=0.358），危險度分組（χ2=1.926，P=0.165），轉移（χ2=2.066，P=0.151），LDH 水平（χ2=0.222，P=0.638）無關（表 1）。

表1 TIAM1蛋白表達與NB患者臨床病理指標之間的關系Tab 1 Relationship between the expression of TIAM1 protein and the clinical characteristics of patients with neuroblastoma

圖1 免疫組化法檢測神經(jīng)母細胞瘤中TIAM1表達情況（IHC×200）Fig 1 The expression of TIAM1 in neuroblastoma（IHC×200）

2.2 生存分析 見圖2。

圖2 NB患者TIAM1陰性表達和陽性表達生存分析Fig 2 Survival analysis ofnegative and positive expression in TIAM1 in NB patients

3 討論

神經(jīng)母細胞瘤是兒童時期最常見的顱外實體腫瘤，全基因組相關研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)，NB是一種復雜的遺傳性疾病，其形成與等位基因的多態(tài)性相關，包括MYCN擴增、ALK突變，LIN28B基因多態(tài)性，ATRX基因組重排等[9]。而與NB發(fā)生或預后密切相關的基因，主要仍是MYCN擴增以及ALK突變[10]。研究表明，Aurora-A對MYCN蛋白表達具有促進作用[11],其過表達與預后不良神經(jīng)母細胞瘤密切相關[12]。但對于Aurora-A抑制劑的研究現(xiàn)今主要仍在動物模型中，例如，有學者證實：在N-MYCN擴增的小鼠模型中，MLN8054和MLN8237這兩種Aurora-A抑制劑，能促進腫瘤消退和延長小鼠生存期[13-14]。另一方面，克唑替尼作為ALK基因突變靶向藥物在非小細胞肺癌得到廣泛運用并取得顯著療效，但由于NB中存在ALK激活點突變，使其對克唑替尼存在敏感性差異，甚至于ALK中某些點突變會對其產(chǎn)生內源性耐藥[15]。并且，MYCN擴增型約占NB的18%～38%，ALK突變主要存在于家族性神經(jīng)母細胞瘤患者中[11，16]。因此，NB的治療遇到瓶頸，需要發(fā)現(xiàn)新的基因、新的有效治療手段來解決這一難題。

在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，軸突生長是通過生長錐的延伸和遷移而發(fā)生的，而TIAM1正向調控生長錐中層脂膜和絲狀偽足[17]，并且可通過激活Rac1、抑制Rho-GTP酶（Rac1促進軸突生長,而Rho激活導致突起回縮），影響軸突形成，促進神經(jīng)元分化[18]。研究證實：TIAM1參與星形膠質細胞突起的極化生長，其缺失導致突起中微管細胞骨架紊亂[19]。同時，TIAM1不僅參與Reelin蛋白介導的施旺細胞的遷移[20]，還與多巴胺能神經(jīng)元的分化和發(fā)育相關[21]。因此，可以得出TIAM1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著至關重要的作用。

神經(jīng)母細胞瘤來源于原始神經(jīng)嵴細胞，主要是因神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)節(jié)細胞和施旺細胞障礙，產(chǎn)生了其他未成熟的神經(jīng)元細胞（神經(jīng)母細胞、節(jié)細胞性神經(jīng)母細胞）而導致NB的發(fā)生[22]。同時，NB是一種常見的具有自發(fā)性消退趨勢的疾病，這種自發(fā)性消退與分化主要存在于低?；颊咭约?S期患者中[23]。研究發(fā)現(xiàn)：神經(jīng)生長因子受體TrkA在低危型及4S期NB中呈高表達狀態(tài)，且當腫瘤微環(huán)境存在NGF（神經(jīng)生長因子）時，其可引起NB分化[24]。此外，TrkA還可增強由Ras介導的細胞變性所引起的NB自我消退效應[25]。

TrkA能促進Rac1活化使TIAM1活性增強。而TIAM1與Ras協(xié)同作用能介導NGF誘導的RAC1活化，產(chǎn)生RAC1依賴的信號級聯(lián)，導致突起生長所需的細胞骨架重塑。因此，TIAM1可作為NGF依賴性突起生長的信號介導因子[26]。Trk受體可激活Ras-GTP酶，使其在神經(jīng)元存活和分化中起關鍵作用。其中，TrkC受體酪氨酸激酶作用于NT3（神經(jīng)營養(yǎng)因子-3），激活Rac1和cdc42促進施旺細胞遷移，而TIAM1為其中的關鍵介質[27]。綜上所述，可以看出TIAM1在神經(jīng)分化中具有重要作用，而這種作用極可能通過TrkA/Ras/Tiam1/Rac1這條通路實現(xiàn)。TrkA、Ras對NB分化起促進作用，因此，TIAM1作為Ras的下游效應分子以及Rac/Rho通路的調節(jié)者，其可能在NB分化中具有重要作用。

上述免疫組化驗證了TIAM1與NB分化相關，且分化程度越高的組織表達越強（圖1）。因此，可以推斷出TIAM1參與并促進NB的分化，可以作為NB治療的潛在靶點。但通過對這52例樣本進行生存分析發(fā)現(xiàn)，TIAM1蛋白高表達與患者3年生存率無明顯相關性（圖2），這可能與樣本量少有關，下一步需擴大樣本量并進一步探討TIAM1在NB分化中的作用并了解其是否能成為NB潛在治療靶點。