王 炬，張秀玲*，高 寧，王韻儀

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150030）

具有藥用功效的植物一般含有多種化學(xué)物質(zhì)，其中許多具有很強(qiáng)的抗氧化活性[1]。近年來研究表明，含有多酚化合物的植物表現(xiàn)出了很強(qiáng)的體外抗氧化能力[2]。多酚化合物是一類具有多羥基酚類化合物的總稱，具有清除自由基、抗衰老、防輻射等抗氧化活性。植物中的多酚化合物可從全株植物中提取，也可從植物的葉、莖和根系中提取，且不同部位提取出的多酚化合物含量與組成均不相同，體現(xiàn)著不同的抗氧化活性[3-4]。

老山芹（Heraclenm dissectum）是傘形科多年生草本植物，多分布于黑龍江、吉林地區(qū)，是生活在東北林區(qū)的居民經(jīng)常食用的一種山野菜，被認(rèn)為是能夠預(yù)防、治療高血壓、高血脂、糖尿病等疾病的一種野生植物。老山芹的季節(jié)性、地域性等生長特性限制了其行業(yè)發(fā)展，但隨著國家對于林下資源的重視和育種、栽培業(yè)的高速發(fā)展，目前已解決了各項(xiàng)限制因素，并在黑龍江省大面積種植、推廣老山芹，其資源十分豐富[5-7]。隨著人們對于健康飲食、以食養(yǎng)生等生活方式的推崇，老山芹這種藥食兼?zhèn)涞闹参飳饾u被人們重視。Gao Yang等[8]通過核磁共振技術(shù)在老山芹根部提取物中鑒定出了5 種常見的香豆素類化合物和芹菜素、山柰酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)老山芹中的化學(xué)成分絕大部分為香豆素類化合物，芹菜素為黃酮類化合物的主要成分。Zhang Hailong等[9]在老山芹甲醇提取物中檢測并鑒定出了茴芹香豆素、7-羥基香豆素等香豆素類化合物。Wang Hongzheng[10]、Sharififar[11]等發(fā)現(xiàn)芹菜素對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基及羥自由基有較強(qiáng)的清除能力；Thuong[12]、Yu Jun[13]等發(fā)現(xiàn)香豆素類化合物對于DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，且抗氧化能力較強(qiáng)。目前國內(nèi)外鮮有對于老山芹及其不同部位提取物體外抗氧化活性的相關(guān)研究。本研究通過測定、分析老山芹及其不同部位總多酚、總黃酮與5 種抗氧化活性指標(biāo)，以期為老山芹功能性食品的開發(fā)與研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老山芹全株植物及老山芹葉、莖均采自黑龍江省加格達(dá)奇農(nóng)林科學(xué)院基地，全部原材料均在1 m的正方形標(biāo)記區(qū)域中采摘，生長周期為7～10 d，2017年4月采收總長度為20 cm（根部距離葉片尖端）全株老山芹，并分離其葉、莖。

福林-酚試劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）、DPPH、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）二銨鹽 美國Sigma公司；VC、水溶性VE（Trolox） 北京Solarbio公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；YP20002電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；LGJ-1A-50型真空冷凍干燥機(jī) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；5428型離心機(jī) 德國艾本德公司；G70D20CN1P-D2（S0）型微波爐 格蘭仕微波生活電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

全株老山芹及老山芹嫩葉、嫩莖均在同一地點(diǎn)、同一時間段內(nèi)采摘，真空冷凍干燥，粉碎過60 目篩，密封低溫保藏備用。多酚的提取方法在李曉英等[3]的基礎(chǔ)上有所改進(jìn)：精確稱取1 g樣品粉末于三角瓶中，加入100 mL經(jīng)鹽酸酸化后的體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液（甲醇與鹽酸體積比100∶0.1），在功率為100 W的微波裝置中浸提30 min，冷卻至室溫，過濾至棕色容量瓶中4 ℃冷藏備用。

1.3.2 總多酚含量的測定

總多酚含量的測定采用福林-酚法，結(jié)果以每克干樣品中沒食子酸質(zhì)量表示。取樣品提取液1 mL于帶刻度試管中，定容至6 mL，加入1 mL福林-酚試劑，充分混勻后加入3 mL 75 g/L碳酸鈉溶液，振蕩搖勻，于75 ℃水浴避光反應(yīng)30 min，在765 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y＝5.39x+0.021（R2＝0.999 1），其中y為吸光度，x為質(zhì)量濃度/（mg/mL）。沒食子酸在0.02～1.00 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性。按式（1）計(jì)算總多酚含量。

式中：ω為樣品中總多酚含量/（mg/g）；ρ為由回歸方程計(jì)算出的提取液總多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液總體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3 總黃酮含量的測定

采用硝酸鋁顯色法測定總黃酮含量，結(jié)果以每克干樣品中蘆丁質(zhì)量表示。取樣品提取液1 mL，加入5 mL蒸餾水、1 mL 50 g/L亞硝酸鈉水溶液，振蕩混勻，靜置6 min后加入1 mL 100 g/L硝酸鋁水溶液，振蕩混勻，靜置6 min，加入10 mL 100 g/L氫氧化鈉水溶液，振蕩混勻，充分反應(yīng)15 min。在510 nm波長處測定其吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y＝0.787x+0.005（R2＝0.999 6），其中y為吸光度，x為質(zhì)量濃度/（mg/mL）。蘆丁在0.04～0.20 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性。按式（1）計(jì)算總黃酮含量（ω），其中ρ為由回歸方程計(jì)算出的提取液總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 鐵還原能力的測定

參照閻林茂[14]、楊少輝[15]等的方法，分別吸取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品提取液，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）、2.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴反應(yīng)20 min后加入2.5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液充分混合，在3 000 r/min下離心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 1 g/L三氯化鐵溶液，充分混勻，以70%甲醇溶液為空白，在700 nm波長處測定其吸光度以表示鐵還原能力；以VC為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。同時，對VC的鐵還原能力作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算達(dá)到同等抗氧化效果時每克干樣品相對于VC的質(zhì)量（mg/g）。

1.3.5 超氧陰離子自由基清除能力測定

參照李斌[16]、張國強(qiáng)[17]等的方法略作改動，分別在試管中加入200 μL不同質(zhì)量濃度的樣品提取液、5.7 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.20）、0.1 mL 6 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合搖勻，25 ℃水浴反應(yīng)6 min，在320 nm波長處測定其吸光度，記為Ai；以等體積的蒸餾水代替樣品提取液測定吸光度，記為A0；以等體積的蒸餾水代替鄰苯三酚溶液測定吸光度，記為At；以VC為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，按照公式（2）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率（Q）。

同時，對不同質(zhì)量濃度的樣品提取液和VC的超氧陰離子自由基清除率作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）和達(dá)到同等抗氧化效果時每克干樣品相當(dāng)于VC的質(zhì)量（mg/g）。

1.3.6 羥自由基清除能力的測定

參照延莎等[18]的方法略作改動。分別在試管中加入1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品提取液、1 mL 10 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 10 mmol/L水楊酸溶液、1 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，迅速冷卻，在510 nm波長處測定其吸光度，記為Ai；以等體積的蒸餾水代替樣品提取液測定吸光度，記為A0；以等體積的蒸餾水代替過氧化氫溶液測定吸光度，記為At；以VC為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，按照公式（2）計(jì)算羥自由基清除率（Q）。

1.3.7 DPPH自由基清除能力的測定

參照J(rèn)ung等[19]的方法并稍作改動，以甲醇為溶劑制備0.1 mmol/L DPPH溶液。在試管內(nèi)加入2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品提取液和2 mL DPPH溶液，室溫避光條件下充分反應(yīng)30 min，以70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇溶液為空白，在517 nm波長處測定其吸光度，記為Ai；以等體積70%甲醇溶液代替樣品提取液測定吸光度，記為A0；以等體積70%甲醇溶液代替DPPH溶液測定吸光度，記為At；以VC為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，按照公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率（Q）。

1.3.8 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

根據(jù)Yang Yao[7]、陳紅梅[20]、Garzón[21]等的方法，將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合，避光放置16 h以生成ABTS陽離子自由基（ABTS溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）。用甲醇稀釋ABTS溶液（30 ℃貯存）以調(diào)節(jié)其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02，記為A0；將3 mL ABTS溶液加入分別裝有30 μL不同質(zhì)量濃度樣品提取液的試管中充分混勻，30 ℃避光反應(yīng)6 min后在734 nm波長處測定其吸光度，記為Ai；以Trolox為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，按照公式（3）計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率。

同時，對不同質(zhì)量濃度的樣品提取液和Trolox對ABTS陽離子自由基清除率作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的IC50和達(dá)到同等抗氧化效果時每克干樣品相當(dāng)于Trolox的質(zhì)量（mg/g）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 老山芹及其不同部位提取物的總多酚、總黃酮含量

從表1可以看出，老山芹全株植物、嫩葉、嫩莖提取物中總多酚含量均高于總黃酮，其中嫩莖提取物總多酚與總黃酮含量相差較大，總多酚是總黃酮含量的2.4 倍。嫩葉提取物總多酚含量是全株植物的1.25 倍、嫩莖的1.78 倍，且3 種樣品間差異性顯著（P＜0.05）。嫩莖提取物中總黃酮含量較低，僅為嫩葉的25%、全株植物的34%；嫩葉提取物總黃酮含量是全株植物的1.34 倍，且3 種樣品之間差異顯著（P＜0.05）?？偟貋碚f，3 種樣品之間總多酚和總黃酮含量為嫩葉＞全株植物＞嫩莖。

表1 老山芹及其不同部位提取物總多酚和總黃酮含量Table 1 Total phenolics and total fl avonoids contents in different parts of Heraclenm dissectum

2.2 老山芹及其不同部位提取物的鐵還原能力

圖1 老山芹及其不同部位提取物的鐵還原能力Fig. 1 Ferric reducing antioxidant power of extracts from different parts of Heraclenm dissectum

在鐵還原能力中，吸光度越高證明其還原能力越強(qiáng)。從圖1可知，3 種樣品的鐵還原能力均隨著質(zhì)量濃度的增大而升高。當(dāng)質(zhì)量濃度為60 μg/mL時，嫩莖與全株植物提取物的鐵還原能力略低于對照組。當(dāng)質(zhì)量濃度為20、40、80 μg/mL時，全株植物與嫩莖提取物的鐵還原能力存在顯著性差異（P＜0.05），嫩葉提取物與對照組的鐵還原能力差異不顯著（P＞0.05），在此質(zhì)量濃度下全株植物提取物的鐵還原能力均為最大。當(dāng)質(zhì)量濃度為100、200 μg/mL時，全株植物、嫩葉、嫩莖提取物與對照組的鐵還原能力差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，鐵還原能力由大到小為嫩莖＞嫩葉＞全株植物；當(dāng)質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，嫩葉提取物的鐵還原能力明顯高于全株植物與嫩莖提取物，是全株植物的1.37 倍、嫩莖的1.48 倍。

2.3 老山芹及其不同部位提取物的超氧陰離子自由基清除能力

由圖2可知，在所有質(zhì)量濃度下3 種樣品提取物的超氧陰離子自由基清除能力均大于對照組，全株植物、嫩葉、嫩莖提取物與對照組的超氧陰離子自由基清除率差異顯著（P＜0.05），且嫩葉提取物清除能力最強(qiáng)（除20.0 μg/mL組）。3 種樣品提取物在20～60 μg/mL范圍內(nèi)超氧陰離子自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增大呈增大趨勢，當(dāng)質(zhì)量濃度大于60 μg/mL時，嫩葉提取物超氧陰離子清除率基本保持在64%，而全株植物雖有增加但趨勢不明顯。對照組、嫩葉、全株植物、嫩莖提取物的IC50分別為189.70、25.52、60.40、65.38 μg/mL。相比于對照組，老山芹全株植物及其各部分提取物的超氧陰離子自由基清除率都較高，說明其具有較高的超氧陰離子自由基清除能力。

圖2 老山芹及其不同部位提取物的超氧陰離子自由基清除能力Fig. 2 Superoxide anion radical scavenging activity of extracts from different parts of Heraclenm dissectum

2.4 老山芹及其不同部位提取物的羥自由基清除能力

圖3 老山芹及其不同部位提取物的羥自由基清除能力Fig. 3 Hydroxyl radical scavenging activity of extracts from different parts of Heraclenm dissectum

從圖3可以看出，老山芹全株植物及不同部位提取物的羥自由基清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，老山芹全株植物、嫩葉、嫩莖提取物和對照組的羥自由基清除率分別為60%、66%、54%、53%，明顯高于其他質(zhì)量濃度，這是因?yàn)樵诖速|(zhì)量濃度下3 種提取物中多酚含量達(dá)到飽和狀態(tài)，與羥自由基充分反應(yīng)；根據(jù)化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)原理，在低質(zhì)量濃度范圍羥自由基清除率與樣品質(zhì)量濃度成正比，當(dāng)增加至較大質(zhì)量濃度（200 μg/mL）時，雖然羥自由基清除率的增長速率較慢，但最終的清除率明顯高于其他質(zhì)量濃度。當(dāng)質(zhì)量濃度為20、80、100 μg/mL時，嫩莖提取物的羥自由基清除率低于對照組。全株植物、嫩葉、嫩莖提取物與對照組的羥自由基清除率在80～200 μg/mL時差異顯著（P＜0.05），且嫩葉提取物的羥自由基清除能力均大于全株植物?？傮w上羥自由基清除能力大小為嫩葉＞全株植物＞嫩莖。老山芹全株植物、嫩葉、嫩莖提取物和對照組的IC50分別為164.64、144.69、180.78、184.50 μg/mL，說明老山芹全株植物和嫩葉提取物對羥自由基的清除能力強(qiáng)于對照組，嫩莖提取物對羥自由基的清除能力相對較弱。

2.5 老山芹及其不同部位提取物的DPPH自由基清除能力

圖4 老山芹及其不同部位提取物的DPPH自由基清除能力Fig. 4 DPPH radical scavenging activity of extracts from different parts of Heraclenm dissectum

從圖4可以看出，除全株植物、嫩莖提取物在10 μg/mL時的DPPH自由基清除率低于對照組外，3 種樣品提取物的DPPH自由基清除率均大于對照組。對照組、全株植物、嫩葉、嫩莖提取物在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時的DPPH自由基清除率分別為80.61%、86.50%、88.10%、87.16%，全株植物與嫩葉提取物之間的DPPH自由基清除率差異顯著（P＜0.05）。在低質(zhì)量濃度（20、40 μg/mL）時，嫩葉、嫩莖提取物與對照組的DPPH自由基清除率差異性顯著（P＜0.05）?？偟膩碚f，嫩葉提取物的DPPH自由基清除能力優(yōu)于嫩莖與全株植物。老山芹全株植物、嫩葉、嫩莖提取物、對照組的IC50分別為25.86、4.90、19.17、24.84 μg/mL。綜上所述，老山芹全株植物及其各部位提取物的DPPH自由基清除能力由高到低為嫩葉＞嫩莖＞全株植物。

2.6 老山芹及其不同部位提取物的ABTS陽離子自由基清除能力

圖5 老山芹及其不同部位提取物的ABTS陽離子自由基清除能力Fig. 5 ABTS radical scavenging activity of extracts from different parts of Heraclenm dissectum

從圖5可以看出，老山芹全株植物及其不同部位甲醇提取物的ABTS陽離子自由基清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增大，且嫩葉提取物在各個質(zhì)量濃度的ABTS陽離子自由基清除率均最大。當(dāng)質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，嫩葉和全株植物提取物的ABTS陽離子自由基清除率分別為75.33%、67.40%，大于Trolox（67.10%），而嫩莖提取物僅為53.14%。在低質(zhì)量濃度（20、40 μg/mL）下，3 種樣品提取物之間的ABTS陽離子自由基清除率差異顯著（P＜0.05），大小為嫩葉＞嫩莖＞Trolox＞全株植物。當(dāng)質(zhì)量濃度為60、80 μg/mL時，全株植物與嫩莖提取物的ABTS陽離子自由基清除率差異不顯著（P＞0.05），3 種樣品ABTS陽離子自由基清除率均大于對照組。老山芹全株植物、嫩葉、嫩莖提取物的IC50分別為129.45、104.13、163.49 μg/mL，而Trolox為129.57 μg/mL。綜上所述，老山芹嫩葉提取物對ABTS陽離子自由基清除能力強(qiáng)于對照組，而全株植物與嫩莖提取物相對于對照組較弱。

2.7 老山芹及其不同部位提取物的體外抗氧化能力

表2 老山芹及其不同部位甲醇提取物體外抗氧化能力Table 2 Analysis of antioxidant capability of methanol extracts from different parts of Heraclenm dissectum

從表2可知，老山芹全株植物、嫩葉與嫩莖提取物的5 種抗氧化能力之間差異顯著（P＜0.05），3 種樣品在超氧陰離子自由基、羥自由基、ABTS陽離子自由基清除能力中分別具有顯著性差異（P＜0.05），但DPPH自由基清除能力較為相似。結(jié)果表明老山芹嫩葉的體外抗氧化能力最強(qiáng)，嫩莖的抗氧化能力相對較弱。

3 討 論

植物所具有的抗氧化活性并不是植物中某種單一化合物作用的結(jié)果，而是由植物中多種酚類物質(zhì)共同作用的結(jié)果，并且抗氧化能力的大小與酚類物質(zhì)的含量密切相關(guān)[22-23]。植物不同部位的多酚物質(zhì)含量與組成均不相同，顯示出不同的抗氧化活性[24-30]。

本研究考察了老山芹全株及其不同部位甲醇提取物的總多酚、總黃酮含量及體外抗氧化能力。老山芹全株植物、嫩莖、嫩葉在鐵還原能力和超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力的測定中表現(xiàn)了較好的抗氧化活性，且具有較大的差異性。結(jié)果表明老山芹嫩葉的抗氧化能力優(yōu)于全株植物與嫩莖。全株植物除對DPPH自由基的清除能力較弱外，對ABTS陽離子自由基等其他4 種自由基的清除能力均強(qiáng)于嫩莖，這一現(xiàn)象可能是因?yàn)槿曛参镏兴幕瘜W(xué)物質(zhì)之間的協(xié)同作用抑制了對DPPH自由基的清除，具體原因在進(jìn)一步分析老山芹植物體中的酚類物質(zhì)組成和抗氧化成分的一級結(jié)構(gòu)后才能得出。同時，老山芹全株植物、嫩葉、嫩莖提取物的5 種抗氧化指標(biāo)雖然分別隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，但三者抗氧化能力的排序隨樣品質(zhì)量濃度的變化而變化，這一現(xiàn)象可能是由于在不同質(zhì)量濃度下老山芹全株植物、嫩葉、嫩莖這3 種樣品提取物之間分別具有不同的抗氧化能力，且3 種提取物與底物反應(yīng)的程度均不相同，所以在實(shí)驗(yàn)中可以看到3 種樣品間抗氧化能力的排序存在些許波動。

老山芹全株植物和嫩葉中含有豐富的酚類物質(zhì)，具有良好的抗氧性，是一種天然的抗氧化劑。因此，未來針對老山芹抗氧化這一功能特性，開發(fā)相關(guān)保健食品具有良好的市場與經(jīng)濟(jì)前景。為了更好地利用這一資源豐富、發(fā)展前景好的林下資源，研究老山芹酚類物質(zhì)的組成與結(jié)構(gòu)，測定各酚類物質(zhì)的含量，優(yōu)化多酚物質(zhì)的提取工藝，了解老山芹中酚類物質(zhì)的協(xié)同、拮抗作用與抗氧化活性之間的相關(guān)性是未來的研究熱點(diǎn)。