覃明雄 ，陳洪濤 ，蔡丹昭 ，劉源煥 ，羅宇東 ，李芳嬋

（1.廣西中醫(yī)藥大學制藥廠，廣西 南寧 530023；2.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530022；3.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200）

惡性腫瘤的發(fā)病率逐年上升，已極大威脅人類健康［1］。中藥治療腫瘤具有多靶點、不易產生耐藥性等優(yōu)勢，已經成為抗腫瘤新藥研發(fā)的新方向［2］。復方白花蛇舌草膠囊是廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院在篩選廣西壯瑤少數(shù)民族民間治療肝癌、肺癌驗方的基礎上，遵循中藥組方基本原則并結合壯瑤藥材的特點，選用白花蛇舌草、半枝蓮、白花丹、紫草、山豆根、蒲葵子、防己、白英、石上柏、小葉金花草、八月札等20味廣西特色藥材進行組方，具有清熱解毒、止血鎮(zhèn)痛、消腫化瘀、益氣固本的功效，臨床上用于肝癌、肺癌的輔助治療效果良好。本課題組將該處方研制成膠囊，并對其進行了抗腫瘤的藥效實驗研究，為復方白花蛇舌草膠囊進入臨床實驗提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g，生產許可證號：SCXK桂2014-0003；SD大鼠，雄性，體重180～200 g，生產許可證：SCXK 桂 2014-0002；均購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 試藥 復方白花蛇舌草膠囊干膏粉（由廣西中醫(yī)藥大學制藥廠提供）。

1.3 細胞株及瘤株 BEL-7402株（人肝癌細胞）、HepG2株（人肝癌細胞）均購自武漢博士德生物工程有限公司；S180及H22肝癌腹水型種鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.4 儀器和試劑 CCK-8檢測試劑盒（日本同仁化學研究所）；DMEM全培養(yǎng)基（武漢博士德生物工程有限公司）；0.25%胰蛋白酶（武漢博士德生物工程有限公司）；吉姆薩工作液（Solarbio）；ALT、AST、TB 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；酶標儀（美國Thermo，Multiskan Go 1510-00607c）；細胞成像儀（美國EVOS FL Auto）。

2 方法與結果

2.1 復方白花蛇舌草膠囊含藥動物血清的制備 取雄性SD大鼠39只，隨機分為4組：空白組3只，復方白花蛇舌草膠囊高、中、低劑量組（劑量分別為14.84 g/kg、7.42 g/kg、3.71 g/kg）每組 12 只。給藥組按10 ml/kg體積灌胃給予相應藥物，空白組予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。在末次給藥30 min、60 min、90 min、120 min，復方白花蛇舌草膠囊各劑量組分別取3只大鼠經腹主動脈采血分離血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用前56℃、30 min滅活。

2.2 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對腫瘤細胞克隆的影響 取對數(shù)生長期的HepG2、BEL-7402細胞，消化計數(shù)，按103個/孔接種于6孔板中，設置空白對照組和含藥血清高、中、低劑量組（末次給藥后60 min），每組平行4孔含藥血清各劑量組作用24 h后更換培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 d，每日觀察，至出現(xiàn)肉眼可見細胞克隆時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，甲醇固定15min，吉姆薩染液染色40min，流水沖洗，晾干，于顯微鏡下觀察并計數(shù)大于50的細胞克隆數(shù)。見表1、表2及圖1、圖2。

表1 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2細胞克隆的影響 （n=4，±s）

表1 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2細胞克隆的影響 （n=4，±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.05

組 別 劑量（g/kg）克隆形成數(shù)空白對照組 — 92.51±10.30含藥血清高劑量組 14.84 64.33±12.16①含藥血清中劑量組 7.42 78.19±9.07含藥血清低劑量組 3.71 89.54±12.63

表2 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對BEL-7402 細胞克隆的影響 （n=4，±s）

表2 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對BEL-7402 細胞克隆的影響 （n=4，±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.05

組 別 劑量（g/kg）克隆形成數(shù)空白對照組 — 114.46±15.34含藥血清高劑量組 14.84 88.07±14.06①含藥血清中劑量組 7.42 95.37±11.48含藥血清低劑量組 3.71 107.16±13.55

圖1 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2細胞克隆的影響

表1、表2結果顯示：與空白對照組比較，復方白花蛇舌草膠囊高劑量含藥血清作用于HepG2、BEL-7402細胞后，細胞的克隆數(shù)目明顯降低，有顯著性差異（P＜0.05），中、低劑量組細胞克隆數(shù)有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示復方白花蛇舌草膠囊含藥血清可有效抑制HepG2、BEL-7402細胞的克隆形成。

圖2 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對BEL-7402細胞克隆的影響

2.3 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對腫瘤細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的HepG2、BEL-7402細胞，制成5×104個/ml單細胞懸液，按每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。實驗設立空白對照組及不同劑量含藥血清組，每個劑量平行4孔，空白對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基。加藥完畢后繼續(xù)孵育24 h，取出96孔板，每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，采用酶標儀于450 nm處測定各孔吸光度OD值。實驗重復3次，計算藥物對細胞的生長抑制率（IR）。抑制率=（1-實驗組OD值/空白對照組OD值）×100%。結果見表3、表4。

表3 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2細胞增殖的影響 （n=4，±s）

表3 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2細胞增殖的影響 （n=4，±s）

OD值 IR OD值 IR OD值 IR OD值 IR空白對照組 — 0.67±0.11 — 0.67±0.11 — 0.67±0.11 — 0.67±0.11 —含藥血清高劑量組 14.84 0.81±0.15 -20.9 1.03±0.14 -53.7 0.61±0.10 9.0 0.86±0.07 -28.4含藥血清中劑量組 7.42 1.01±0.15 -50.7 0.53±0.07 20.9 0.56±0.11 16.4 0.77±0.06 -14.9含藥血清低劑量組 3.71 0.64±0.21 4.5 0.62±0.06 7.5 0.65±0.14 3.0 0.66±0.13 1.5組 別 劑量（g/kg）30 min 60 min 90 min 120 min

表4 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對BEL-7402細胞增殖的影響 （n=4，±s）

表4 復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對BEL-7402細胞增殖的影響 （n=4，±s）

OD值 IR OD值 IR OD值 IR OD值 IR空白對照組 — 0.89±0.16 — 0.89±0.16 — 0.89±0.16 — 0.89±0.16 —含藥血清高劑量組 14.84 0.82±0.11 7.9 0.72±0.11 19.1 0.76±0.14 14.6 0.82±0.15 7.9含藥血清中劑量組 7.42 0.90±0.08 -1.1 0.87±0.16 2.2 0.86±0.08 3.4 0.76±0.07 14.6含藥血清低劑量組 3.71 0.94±0.17 -5.6 0.91±0.13 -2.2 0.91±0.09 -2.2 0.93±0.18 -4.5組 別 劑量（g/kg）30 min 60 min 90 min 120 min

表3、表4結果顯示：與空白對照組比較，各劑量、各時間點的復方白花蛇舌草膠囊含藥血清處理細胞后OD值無明顯差異（P＞0.05），提示復方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2、BEL-7402細胞增殖無明顯抑制作用。

2.4 復方白花蛇舌草膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 取小鼠50只，隨機分成5組：空白對照組、香菇菌多糖片組（5 mg/kg）及復方白花蛇舌草膠囊高、中、低劑量組（劑量分別為 21.2 g/kg、10.6 g/kg、5.3 g/kg），每組10只。各給藥組灌胃給予相應藥物，空白對照組灌服等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，每只小鼠腹腔注射20%雞紅細胞懸液1 ml，0.5 h后脫臼頸椎處死動物，腹腔注射生理鹽水2 ml，輕揉腹部1 min，用碘伏消毒腹部，剪開皮膚，抽取腹腔沖洗液，分滴于2片載玻片上，每片0.2 ml。將載玻片放在墊有濕紗布的搪瓷盤中，置37℃溫箱中孵育30 min，取出載玻片，用生理鹽水漂洗除去未貼片的細胞，晾干，瑞特氏染液染色，顯微鏡下觀察，每片計數(shù)100個巨噬細胞，按下式計算吞噬率（%）和吞噬指數(shù)。吞噬率（%）=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/100個巨噬細胞×100%；吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞數(shù)/100個巨噬細胞。結果見表5。

表5 復方白花蛇舌草膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 （±s）

表5 復方白花蛇舌草膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 （±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg）吞噬率（%）吞噬指數(shù)空白對照組 10 — 29.5±7.72 1.10±0.24香菇菌多糖片組 10 0.005 62.0±5.89① 1.62±0.37①復方白花蛇舌草膠囊高劑量組 10 21.2 51.0±4.16① 1.41±0.22①復方白花蛇舌草膠囊中劑量組 10 10.6 26.5±3.12 1.06±0.31復方白花蛇舌草膠囊低劑量組 10 5.3 26.0±5.65 1.17±0.28

表5結果顯示：與空白對照組比較，香菇菌多糖片組和復方白花蛇舌草膠囊高劑量組的吞噬率和吞噬指數(shù)明顯升高，有顯著性差異（P＜0.01）；而復方白花蛇舌草中、低劑量組吞噬率和吞噬指數(shù)無明顯變化。提示復方白花蛇舌草膠囊對巨噬細胞的吞噬功能有一定活化作用。

2.5 復方白花蛇舌草膠囊對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用 選取昆明種小鼠50只，隨機分成5組：H22荷瘤對照組、氟尿嘧啶組（0.02 g/kg）、復方白花蛇舌草膠囊高、中、低劑量組（劑量分別為 21.2 g/kg、10.6 g/kg、5.3 g/kg），每組10只。無菌取腹腔內傳代7 d的H22肉瘤細胞，將細胞濃度調整為5×106個/ml，按每只0.2 ml接種于各組小鼠右腋皮下。接種24 h后，各用藥組按20 ml/kg灌胃體積給予相應藥物，H22荷瘤對照組給予蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后3 h，處死小鼠，剝離完整腫瘤組織，電子天平稱量瘤體濕重。與H22荷瘤對照組比較，計算平均瘤重和抑瘤率，結果見表6。

表6 各組對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用比較 （±s）

表6 各組對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用比較 （±s）

注：與 H22荷瘤對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg）平均瘤重（g）抑瘤率（%）H22荷瘤對照組 10 — 0.57±0.19 —氟尿嘧啶組 10 0.02 0.21±0.13② 63.16復方白花蛇舌草膠囊高劑量組 10 21.2 0.40±0.11① 29.82復方白花蛇舌草膠囊中劑量組 10 10.6 0.36±0.12① 36.84復方白花蛇舌草膠囊低劑量組 10 5.3 0.49±0.20 14.03

表6結果顯示：與H22荷瘤對照組比較，氟尿嘧啶組及復方白花蛇舌草膠囊高、中劑量組的平均瘤重明顯降低，有顯著性差異（P＜0.05或 P＜0.01）；復方白花蛇舌草膠囊低劑量組平均瘤重有降低的趨勢，但差異無顯著性意義（P＞0.05）。提示復方白花蛇舌草膠囊對H22荷瘤小鼠的腫瘤生長有一定的抑制作用。

2.6 復方白花蛇舌草膠囊對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用 選取昆明種小鼠50只，隨機分成5組：S180荷瘤對照組、氟尿嘧啶組（0.02 g/kg）、復方白花蛇舌草膠囊高、中、低劑量組（劑量分別為 21.2 g/kg、10.6 g/kg、5.3 g/kg），每組10只。無菌取腹腔內傳代7 d的S180肉瘤細胞，將細胞濃度調整為5×106個/ml，按每只0.2 ml接種于各組小鼠右腋皮下。接種24 h后，各用藥組按20 ml/kg灌胃體積給予相應藥物，S180荷瘤對照組給予蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后3 h，處死小鼠，剝離完整腫瘤組織，電子天平稱量瘤體濕重，與S180荷瘤對照組比較，計算平均瘤重和抑瘤率，結果見表7。

表7 各組對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用比較 （±s）

表7 各組對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用比較 （±s）

注：與S180荷瘤對照組比較，①P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg）平均瘤重（g）抑瘤率（%）S180荷瘤對照組 10 — 2.26±0.97 —氟尿嘧啶組 10 0.02 1.08±0.65① 52.21復方白花蛇舌草膠囊高劑量組 10 21.2 1.96±0.93 13.27復方白花蛇舌草膠囊中劑量組 10 10.6 2.17±0.81 3.98復方白花蛇舌草膠囊低劑量組 10 5.3 1.93±0.88 14.60

表7結果顯示：與S180荷瘤對照組比較，氟尿嘧啶組平均瘤重明顯降低，有顯著性差異（P＜0.01）；復方白花蛇舌草膠囊高、中、低劑組平均瘤重有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示復方白花蛇舌草膠囊對S180荷瘤小鼠的腫瘤生長未能表現(xiàn)出有效抑制。

3 討 論

復方白花蛇舌草膠囊選用白花蛇舌草、半枝蓮為君藥，白花蛇舌草具有清熱解毒功效，現(xiàn)代藥理學研究證實其對人肝癌、肺癌、結腸癌等癌細胞均具有抑制或誘導凋亡作用［3-5］；半枝蓮可清熱解毒、化瘀利尿，其提取物可抑制肺癌MCF7細胞增殖［6］，所含的槲皮素能抑制前列腺癌細胞的生存和繁殖［7］；網絡藥理學分析，半枝蓮的活性成分對前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌有顯著作用［8］。二藥聯(lián)用，增強了處方藥物的抗腫瘤能力。

由于中藥口服后其成分常在胃腸道內受到消化液和腸道微生物作用，其有效成分并不一定與體內直接發(fā)揮作用的成分相符，而用含藥血清進行藥理實驗更能反應中藥的藥理作用與有效成分的關系［9］。因此我們制備了復方白花蛇舌草膠囊含藥血清，觀察其在體外對腫瘤細胞的作用。

腫瘤細胞具有永生性，因此可以由一個祖先細胞增殖形成克隆，而分化成熟的細胞則不能形成。將處理后的腫瘤單細胞在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每個有腫瘤特性的細胞就能形成克隆，因此克隆形成數(shù)反映了腫瘤細胞生存增殖能力［10］。復方白花蛇舌草膠囊含藥血清能有效抑制HepG2、BEL-7402細胞的克隆形成，說明復方白花蛇舌草膠囊對體外培養(yǎng)的人肝癌細胞具有抑制克隆形成的能力，但對相應癌細胞增殖的抑制作用不明顯。

巨噬細胞既可作為免疫調節(jié)細胞也能作為效應細胞去破壞、清除靶細胞，還可以識別腫瘤細胞并對其進行非特異性的免疫應答［11］。復方白花蛇舌草膠囊高劑量組對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能有顯著活化作用，其抗腫瘤作用可能與這一免疫調節(jié)功效有關。

本實驗建立了H22荷瘤小鼠和S180荷瘤小鼠兩個模型，觀察復方白花蛇舌草膠囊體內抗腫瘤活性。結果顯示，復方白花蛇舌草膠囊高、中劑量組的平均瘤重明顯低于H22荷瘤對照組，其中中劑量組對H22荷瘤小鼠抑瘤率達36.84%，說明復方白花蛇舌草膠囊不但對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞有一定的抗腫瘤作用，也能在體內抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長。

由于中藥制劑較少單用于抗腫瘤臨床治療，復方白花蛇舌草膠囊原處方在臨床上也是用于放化療后的輔助治療。有研究報道，中藥組方在荷瘤小鼠化療過程中可發(fā)揮減毒增效作用［12-14］，因此，本課題組將進一步開展復方白花蛇舌草膠囊與放化療藥物聯(lián)用的抗腫瘤作用研究，以為臨床實踐提供科學依據(jù)。