劉昱 閻瀾 姜遠(yuǎn)英

(海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系軍特藥研究中心，上海 200433)

真菌細(xì)胞壁在真菌的生存與致病中發(fā)揮著重要作用，并作為重要的抗真菌新藥靶標(biāo)被廣泛研究[1]。細(xì)胞壁中大部分蛋白質(zhì)是通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol，GPI)殘基錨定于細(xì)胞壁葡聚糖層上的GPI錨定蛋白，在真菌細(xì)胞壁的形態(tài)維持與修復(fù)、毒力因子形成以及環(huán)境應(yīng)激作用等生命活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2-3]，抑制GPI的合成將影響細(xì)胞壁中GPI錨定蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位，減少真菌細(xì)胞壁蛋白的含量，影響蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的發(fā)揮并破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。目前已被研發(fā)出的GPI合成抑制劑包括10b、E1210(APX001A)和G884等[4-7]，我們通過(guò)對(duì)上述幾種化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，合成并篩選出具有抗真菌活性的化合物NT-89(見圖1)，并驗(yàn)證了NT-89能夠抑制白念珠菌GPI合成與運(yùn)輸并破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[8]。由于細(xì)胞壁中存在一百多種已知的GPI錨定蛋白[2]，僅通過(guò)幾種細(xì)胞壁蛋白的含量變化難以全面反映NT-89對(duì)真菌細(xì)胞壁蛋白的實(shí)際影響，因此我們采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)方法，分析NT-89作用前后白念珠菌細(xì)胞壁GPI錨定蛋白的含量變化，并分析對(duì)其他通路或結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)的影響。

圖1 現(xiàn)有的GPI合成抑制劑與NT-89的結(jié)構(gòu)

Fig.1The chemistry structures of GPI synthesis inhibitors and NT-89

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification，iTRAQ)技術(shù)，是利用不同分子量的同位素標(biāo)記不同樣品蛋白質(zhì)組中的多肽肽段，并利用LC-MS產(chǎn)生的不同標(biāo)記的特征離子峰，分離并識(shí)別不同肽段及其豐度，從而實(shí)現(xiàn)相對(duì)或絕對(duì)定量的蛋白質(zhì)組學(xué)方法[9]。這一技術(shù)具有靈敏度高、分離能力強(qiáng)等特點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)以及細(xì)胞凋亡等生命過(guò)程中蛋白標(biāo)記物的研究等[10-11]。本研究中，我們將利用iTRAQ技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析，對(duì)NT-89處理前后的白念珠菌進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。除提取總蛋白外，我們還采用氟化氫吡啶(HF-pyridine)提取法，嘗試直接提取并檢測(cè)細(xì)胞壁蛋白，以求更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞壁GPI錨定蛋白含量變化[12-13]。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 實(shí)驗(yàn)使用國(guó)際實(shí)驗(yàn)室通用菌株白念珠菌SC5314，由美國(guó)華盛頓喬治敦大學(xué)免疫微生物教研室的William A. Fonzi教授惠贈(zèng)。

培養(yǎng)基 YPD(yeast pentose dextrose)培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，蛋白胨10 g， D-葡萄糖20 g，加入三蒸水混勻并定容至1000 mL，高溫高壓(121 °C，30 min)滅菌后于4 °C保存?zhèn)溆?。沙氏葡萄糖瓊?Sabouraud dextrose agar，SDA)培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g， D-葡萄糖40 g，瓊脂粉20 g，加入三蒸水混勻并定容至1000 mL，高溫高壓(121 °C，30 min)滅菌后，倒入90 mm直徑的培養(yǎng)皿中，冷卻至室溫凝固后備用。

藥品 實(shí)驗(yàn)使用的抗真菌化合物NT-89由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室合成。使用前溶于DMSO中，保存于-20 °C。

試劑 ①總蛋白提取使用試劑如下：蛋白裂解液：Tris-HCl 50 mmol/L, EDTA 5 mmol/L, DTT 10 mmol/L，1% Triton-100X, 10% 甘油，加入超純水溶解混勻，使用前加入蛋白酶抑制劑cocktail：Leupeptin 10 μg/mL(約20 μmol/L)，Pepstatin A 7 μg/mL(約1 μmol/L)，antipain 5 μg/mL，PMSF 1 mmol/L。②細(xì)胞壁蛋白提取使用試劑如下：

蛋白裂解液 Tris 1.21 g， HCl調(diào)pH值至7.5, 1000 mL超純水溶解，使用前加入蛋白酶抑制劑cocktail：Leupeptin 10 μg/mL(約20μmol/L)，Pepstatin A 7 μg/mL(約1 μmol/L)，Aprotinin 5 μg/mL， PMSF 1mmol/L。SDS提取液： SDS 0.2 g，Tris 6.05 g(50 mmol/L)，DTT 1.54 g(10 mmol/L)，EDTA 0.0292 g(0.1 mmol/L)，1000 mL超純水溶解后，HCl調(diào)pH值至8.0，置于室溫備用。

儀器 Precellys 24 多功能樣品均質(zhì)器(Bertin Technologies)；Thermo Heraeus Fresco 21 微量冷凍離心機(jī); Biospec Bead-beater 攪拌式研磨珠均質(zhì)器；Thermo Heraeus Multifuge X1R高性能通用臺(tái)式離心機(jī)；Tecan Infinite 200 Pro 多功能酶標(biāo)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

白念珠菌活化與加藥培養(yǎng) -80 °C凍存的白念珠菌SC5314菌株劃線接種至SDA培養(yǎng)基平板表面，30 °C靜置培養(yǎng)48 h，之后挑取5個(gè)單克隆菌落接種至1 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 °C、200 rpm振搖培養(yǎng)16 h。菌液按1∶100的比例接種至加入NT-89 0.08 μg/mL 或不加藥的YPD培養(yǎng)基中，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)16 h用于總蛋白或細(xì)胞壁蛋白的提取。

總蛋白(Total Protein，TP)提取 菌株按上述過(guò)程活化并加藥或不加藥培養(yǎng)后，吸取1 mL菌液，4000 r/min離心2 min收集菌體，加入PBS洗滌3次，4000 r/min離心2 min，棄上清后，調(diào)整各管中菌體濕重至每管菌量約為20 mg，加入蛋白裂解液700 μL重懸菌體，轉(zhuǎn)移懸液至已加入等體積玻璃珠(0.5 mm)的提取管中并置于冰浴中。使用Precellys 24多功能均質(zhì)器，以30 s×20次的程序破碎菌體，其間冰浴降溫20 s以上，破碎后4 °C、13000 r/min離心10 min，小心吸取上清溶液，即獲得總蛋白提取液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。

細(xì)胞壁蛋白(Cell Wall Protein，CWP)提取 菌株活化后，各組分別將3 mL菌液傳入300 mL加藥或不加藥的YPD培養(yǎng)基中，按前述條件繼續(xù)培養(yǎng)16 h，3000 r/min離心5 min，分多次收集菌體，加入PBS洗滌3次，收集菌體。加入裂解液20 mL并置于冰浴中，加入等體積的玻璃珠(0.5 mm，約40 mL)，使用Bead-beater均質(zhì)器，以30 s×60次的程序破碎菌體，其間冰浴降溫30 s。吸取破壁后液體， 4 °C、5000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞壁碎片。將碎片用冷的超純水(含1 mmol/L PMSF)洗滌5次，之后依次用5%、2%和1% 的NaCl溶液(含1 mmol/L PMSF)各洗滌5次，最后用冷的超純水(含1 mmol/L PMSF)再洗滌1次，5000 r/min離心5 min收集沉淀。向沉淀中加入SDS提取液15 mL，95°C水浴加熱10 min，5000 r/min離心10 min，棄上清，再重復(fù)此步驟1次。用冷的超純水(含1 mmol/L PMSF)洗滌1次，5000 r/min離心10 min收集細(xì)胞壁碎片并凍存于-80 °C。稱取約0.6 g濕重的細(xì)胞壁碎片，加入氟化氫吡啶(HF-pyridine)3 mL，冰浴3 h后，加入3 mL冷超純水，全部轉(zhuǎn)移至25 kD的透析袋中，4°C透析24 h，吸取透析袋內(nèi)上清液，即獲得細(xì)胞壁蛋白提取液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。

iTRAQ檢測(cè)與生物信息學(xué)分析 四組蛋白樣品送至上海美吉生物(Majorbio)公司進(jìn)行iTRAQ檢測(cè)與生物信息學(xué)分析。在對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)與濃度測(cè)定后，將每組樣品分為兩份平行測(cè)定，共計(jì)8個(gè)樣品，分別標(biāo)記并進(jìn)樣檢測(cè)，各組結(jié)果取兩份樣品的平均值。每組蛋白樣品取90 μg進(jìn)行還原烷基化和酶解后，加入8個(gè)不同分子量的iTRAQ 8PLEX標(biāo)記處理，將全部樣品混合后進(jìn)樣UPLC-MS檢測(cè)標(biāo)記肽段。利用ProteomeDiscoverer Software 2.1軟件搜索UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)獲得肽段及對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)信息，利用iTRAQ標(biāo)記的特征峰獲得蛋白的相對(duì)豐度。利用GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能分類注釋。有關(guān)蛋白質(zhì)或基因的功能描述信息參考自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CGD。使用R語(yǔ)言中t.test函數(shù)計(jì)算樣本間差異顯著性的P值，顯著差異表達(dá)蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：①P<0.05；②蛋白相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)>1.3或<0.77。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)提取液質(zhì)量檢查

蛋白提取送樣后，首先利用SDS-PAGE初步鑒定蛋白質(zhì)提取液的質(zhì)量，以評(píng)價(jià)是否適合進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)，并比較兩種提取液中蛋白質(zhì)組成與分布的差異。結(jié)果顯示(見圖 2)，兩種方法均有效提取出白念珠菌的蛋白質(zhì)成分，且蛋白質(zhì)分子量差異較為明顯，其中總蛋白的條帶(1、2)中，蛋白分子量在10～180 kD均有分布，較多集中在40～180 kD，與之相比，細(xì)胞壁蛋白(3、4)的分子量較多集中在40 kD以下。

2.2 差異蛋白組成分析

本實(shí)驗(yàn)中，將加藥前后提取的總蛋白與細(xì)胞壁蛋白共四組樣品蛋白混合進(jìn)樣后，共檢測(cè)到有效蛋白3557種?？偟鞍捉M(以下簡(jiǎn)稱TP組)中有效差異蛋白共計(jì)295種，其中上調(diào)蛋白199種，下調(diào)蛋白96種；細(xì)胞壁蛋白組(以下簡(jiǎn)稱為CWP組)中有效差異蛋白共計(jì)975種，其中上調(diào)蛋白493種，下調(diào)蛋白482種。通過(guò)對(duì)差異蛋白的在細(xì)胞成分中的組成的GO分析(見表1)，我們發(fā)現(xiàn)在CWP組的差異蛋白中，膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器中的差異蛋白占比例較高，部分已接近甚至超過(guò)TP組中的占比，而位于細(xì)胞壁、細(xì)胞表面或胞外的差異蛋白占比略低。造成這一現(xiàn)象的原因可能由于破碎菌體獲得的細(xì)胞碎片中，除了細(xì)胞壁碎片外，還包含了細(xì)胞器等胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的碎片，其中附著或鑲嵌在膜結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)在洗滌處理細(xì)胞碎片過(guò)程中仍部分殘留于膜碎片中，或者有部分胞內(nèi)蛋白附著于細(xì)胞壁內(nèi)表面上，在提取細(xì)胞壁蛋白時(shí)，這部分蛋白也脫落并游離在提取液中，由于iTRAQ技術(shù)的高靈敏度，使得這些含量不定的殘留蛋白能夠被檢測(cè)出來(lái)，而差異的產(chǎn)生很可能則是在細(xì)胞碎片處理過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白殘留量的差異，不能確定是否為藥物的影響，同時(shí)我們認(rèn)為檢測(cè)出的細(xì)胞壁GPI錨定蛋白應(yīng)主要為直接從細(xì)胞壁碎片中提取的蛋白，不包含已在胞內(nèi)合成但未定位至細(xì)胞壁上的蛋白成分，因此在分析CWP組差異蛋白時(shí)，應(yīng)主要參考細(xì)胞壁或細(xì)胞表面等結(jié)構(gòu)上的蛋白，胞內(nèi)差異蛋白結(jié)果則應(yīng)以TP組為準(zhǔn)。

圖2兩種蛋白提取物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。1和2表示總蛋白的對(duì)照組與NT-89處理組，3和4表示細(xì)胞壁蛋白的對(duì)照組與NT-89處理組

Fig.2SDS-PAGE results of protein extracts. 1 and 2 represent the control and NT-89 group of total protein (TP), and 3 and 4 represent the cell wall protein (CWP)

我們接下來(lái)分析了總蛋白中含量增加最多與減少最多的各20種差異蛋白及其功能(蛋白基因與功能信息參考NCBI與CGD數(shù)據(jù)庫(kù))。在相對(duì)表達(dá)量減少最多的20種蛋白中(見表2)，有5種為GPI錨定蛋白，其中Ywp1p與Pga10p兩種蛋白在總蛋白中含量減少最多，Ywp1p在白念珠菌在宿主的傳播中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Pga10p為RPMI1640培養(yǎng)基中生物被膜形成的必需成分之一，此外一些如Hsp家族蛋白和黏附素樣蛋白等的含量均顯著降低。

而在相對(duì)表達(dá)量增加最多的20種蛋白中沒有出現(xiàn)GPI錨定蛋白(見表3)，但在其中有7種蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)合成加工過(guò)程中發(fā)揮作用，例如在總蛋白中相對(duì)表達(dá)含量增加最多的、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的靶向定位、信號(hào)肽加工和信號(hào)肽酶復(fù)合物的定位等過(guò)程中發(fā)揮作用的信號(hào)肽酶復(fù)合物亞基蛋白(XP_019330933.1)，以及Sec61p等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的增加，提示NT-89作用后由于蛋白質(zhì)合成與運(yùn)輸?shù)娜毕菀约暗竭_(dá)相應(yīng)定位位置的蛋白含量減少，可能使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工運(yùn)輸過(guò)程被反饋性增強(qiáng)，以補(bǔ)償NT-89引起的蛋白質(zhì)運(yùn)輸及定位的缺陷。

2.3 細(xì)胞壁GPI錨定蛋白的差異蛋白分析

隨后我們綜合分析了總蛋白與細(xì)胞壁蛋白中GO分類注釋為二級(jí)分類“extracellular region”(GO：0005576)、三級(jí)分類“cell surface”(GO：0009986)以及四級(jí)分類“cell wall”(GO：0005618)的差異蛋白，將位于這三個(gè)分類中的蛋白統(tǒng)一看做細(xì)胞壁或細(xì)胞表面蛋白。以上三種分類中，TP組共有42種差異蛋白，其中下調(diào)蛋白23種；CWP組共有52種差異蛋白，其中下調(diào)蛋白26種；兩組的共同差異蛋白27種，其中共同下調(diào)蛋白14種，共同上調(diào)蛋白12種(見圖3)。

我們隨后查找并分析了兩組的共同差異蛋白中CWP組的細(xì)胞壁GPI錨定蛋白及相關(guān)信息(見表4)，得到6種表達(dá)下調(diào)的GPI錨定蛋白(Ywp1p、Pga10p、Plb4.5p、Pga4p、Rhd3p、Pga45p)，以及5種表達(dá)上調(diào)蛋白的GPI錨定蛋白(Sod5p、Utr2p、Sap9p、Crh11p、Phr1p)。上調(diào)的GPI錨定蛋白多與細(xì)胞修復(fù)與細(xì)胞完整性有關(guān)，其中Sap9p在黏附與維持細(xì)胞表面完整性方面發(fā)揮作用，Crh11p與Phr1p均為與細(xì)胞壁葡聚糖合成相關(guān)的酶，而UTR2基因的誘導(dǎo)則發(fā)生在細(xì)胞壁的再生修復(fù)過(guò)程中。這些蛋白的表達(dá)上調(diào)可能由于NT-89作用后細(xì)胞壁中蛋白的減少導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，從而觸發(fā)了細(xì)胞的反饋調(diào)節(jié)，引起細(xì)胞壁的修復(fù)以及部分細(xì)胞壁蛋白合成的增強(qiáng)。

圖3兩種蛋白提取物中細(xì)胞壁與細(xì)胞表面差異蛋白Venn圖。大圓表示分組中全部差異蛋白，小圓代表下調(diào)蛋白

Fig.3Venn of differential proteins on the surface or in the cell wall in two protein extracts. Big circles indicate all the differential proteins, and small circles indicate down-regulated proteins

表1 兩種蛋白質(zhì)提取物的差異蛋白在不同GO分類中的分布

表2 總蛋白中NT-89處理后下調(diào)最多的蛋白

(續(xù)表)

* 準(zhǔn)確的或者可能性最大的表達(dá)基因

** GPI錨定蛋白用加粗字體表示

表3 總蛋白中NT-89處理后上調(diào)最多的蛋白

表4 CWP組細(xì)胞壁GPI錨定蛋白的差異蛋白

3 討 論

在本研究中，我們主要利用iTRAQ技術(shù)對(duì)NT-89處理前后的白念珠菌進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。為避免細(xì)胞內(nèi)未能運(yùn)輸結(jié)合至細(xì)胞壁的GPI錨定蛋白的干擾，除了采用一般提取白念珠菌總蛋白的方法外，我們還嘗試采用氟化氫吡啶提取法直接提取細(xì)胞壁GPI錨定蛋白。從結(jié)果上看，在氟化氫吡啶提取出的蛋白中還含有大量的胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)或細(xì)胞器中的蛋白，造成這一現(xiàn)象的原因除了因iTRAQ技術(shù)自身的靈敏度與混合進(jìn)樣等因素的影響外，還可能由于氟化氫吡啶提取方法自身存在不足，文獻(xiàn)中已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，除了細(xì)胞壁中的GPI錨定蛋白外，氟化氫吡啶提取產(chǎn)物中還包含有數(shù)十種分類為非細(xì)胞壁蛋白的成分[12]，原因可能為細(xì)胞碎片處理過(guò)程中膜結(jié)構(gòu)以及膜上鑲嵌或附著的蛋白未被完全除去，同時(shí)我們認(rèn)為檢測(cè)到的細(xì)胞壁中的蛋白則應(yīng)當(dāng)主要來(lái)自于細(xì)胞壁碎片，不包含胞內(nèi)已合成但未定位的細(xì)胞壁蛋白，因此氟化氫吡啶提取物即CWP組的差異蛋白結(jié)果適用于細(xì)胞壁與細(xì)胞表面的差異蛋白分析。

在總蛋白提取物中，下調(diào)差異最大的20種差異蛋白中排名最高的Ywp1p與Pga10p均為GPI錨定蛋白，同時(shí)在細(xì)胞壁提取物的差異蛋白中，共檢測(cè)到6種被顯著下調(diào)的細(xì)胞壁GPI錨定蛋白。上述結(jié)果說(shuō)明NT-89能夠影響白念珠菌細(xì)胞壁GPI錨定蛋白的含量及分布，并影響了白念珠菌的生物被膜形成等生命活動(dòng)。而通過(guò)對(duì)上調(diào)最多的蛋白以及細(xì)胞表面出現(xiàn)上調(diào)的GPI錨定蛋白的分析，我們發(fā)現(xiàn)NT-89處理后的白念珠菌中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)合成及胞內(nèi)蛋白質(zhì)的運(yùn)輸均被增強(qiáng)，而含量增加的GPI錨定蛋白多與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)修復(fù)有關(guān)。綜合上述結(jié)果，我們推斷在NT-89作用后，由于細(xì)胞壁表面蛋白質(zhì)合成運(yùn)輸?shù)娜毕?，?dǎo)致了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞，而修復(fù)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的GPI錨定蛋白的含量也在藥物作用下減少，因此細(xì)胞為修復(fù)被破壞的細(xì)胞壁，從而增強(qiáng)了蛋白質(zhì)與細(xì)胞壁物質(zhì)的合成，導(dǎo)致與這些過(guò)程有關(guān)的蛋白表達(dá)增加。

綜上所述，本研究主要利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)檢測(cè)NT-89處理后白念珠菌蛋白質(zhì)含量變化，并對(duì)蛋白的分類進(jìn)行GO分析，驗(yàn)證了NT-89能夠減少細(xì)胞表面的GPI錨定蛋白含量，并推測(cè)出部分GPI錨定蛋白含量增加是由于NT-89引起的細(xì)胞壁蛋白減少和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞引起的反饋性修復(fù)與代償調(diào)節(jié)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)能夠?yàn)樗幬锏淖饔冒悬c(diǎn)與機(jī)制的研究提供大量有價(jià)值的信息，而現(xiàn)有GPI錨定蛋白抑制劑研究中尚未報(bào)道過(guò)類似研究方法，因此本研究中對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法的應(yīng)用將為同類藥物的機(jī)制研究提供有效參考與借鑒，除此之外，探索出更加高效的真菌細(xì)胞壁蛋白提取方法將更加有利于此類研究的開展。