李丹丹，孫春霞，喬媛媛，馬偉，馮友新，張達矜，

(1南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣州510515；2中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心)

膠質瘤是顱內最常見且預后最差的惡性腫瘤。由于膠質瘤呈彌漫性生長，并影響和侵襲正常腦組織，手術常難徹底切除，且術后放療效果欠佳[1]。手術、放療和輔以替莫唑胺(TMZ)化療是目前新診斷的神經膠質瘤患者首選治療方案，但是效果并不理想[2]。富含酸性的核磷蛋白32家族成員(ANP32)家族蛋白與腫瘤進展，損傷保護以及藥物耐受密切相關。其中磷蛋白32(pp32)最初發(fā)現(xiàn)時被認為是一種抑瘤因子，然而隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)其與肝癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤的進展密切相關，并參與調控胰腺癌、乳腺癌等對化學毒物的敏感性[3,4]。我們前期研究[5]表明，pp32在哺乳動物腦組織中高表達，并參與神經發(fā)育過程。最近研究[6]表明，pp32在膠質瘤組織中高表達，但其在膠質瘤病情進展、耐藥機制中的作用尚不明確。2016年10月～2018年10月，我們觀察了pp32高表達人膠質瘤細胞株U251加入TMZ、H2O2以及乙醇作用后細胞增殖活性的變化，并探討了其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、pp32慢病毒、試劑及儀器 細胞：人膠質瘤細胞株U251(北京協(xié)和醫(yī)院細胞資源中心)。該細胞在含有10%胎牛血清以及100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。pp32高表達慢病毒、pp32高表達陰性對照慢病毒、pp32干擾慢病毒以及pp32干擾陰性對照慢病毒(上海吉凱基因公司)。主要試劑：人pp32重組蛋白為本實驗室制備和保存[7]。MEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素(Gibco公司)，胎牛血清(Sciencell公司)，CCK-8試劑盒(Dojindo公司)，pp32、actin以及人類抗原R(HuR)抗體(Santa Cruz公司)，增殖細胞核抗原(PCNA)、二步法免疫組化檢測試劑以及DAB顯色試劑盒(中杉金橋公司)，TMZ(sigma公司)，30% H2O2、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)。儀器：CO2細胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機以及生物安全柜(Thermo公司)，普通光學顯微鏡、熒光倒置相差顯微鏡(Nikon公司)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，電泳儀、轉膜儀以及酶標儀(伯樂公司)，ImageQuant LAS 4000凝膠成像儀(GE公司)。

1.2 穩(wěn)定低或高表達pp32 U251細胞株的建立及篩選 收集對數期生長期人膠質瘤U251細胞，3×106/孔接種于6孔板培養(yǎng)12 h后，按照細胞與病毒1∶10的比例加入慢病毒，8 h后更換細胞培養(yǎng)基，待繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入終濃度為3.5 μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)2周構建穩(wěn)轉細胞，pp32高表達慢病毒穩(wěn)轉染的U251細胞作為32A組，pp32高表達陰性對照慢病毒穩(wěn)轉染的U251細胞作為32A-C組，pp32干擾慢病毒穩(wěn)轉染的U251細胞作為siA組，pp32干擾陰性對照慢病毒穩(wěn)轉染的U251細胞株作為siA-C組。未經轉染的U251細胞作為NC組。采用Western blotting法檢測pp32蛋白以明確目的細胞株的構建是否成功。

1.3 加入TMZ、H2O2、無水乙醇后各組U251細胞增殖活性的檢測 ①采用CCK-8實驗檢測細胞光密度值(OD值)。將對數生長期32A、32A-C、siA、siA-C組細胞以及正常U251細胞(NC組)按照5×103/孔接種于96孔板中8 h后，分別加入100 μg/mL TMZ、0.15 mmol/mL H2O2以及600 mmol/mL乙醇，每組設置3個復孔。分別于0、12、24 h后加入CCK-8試劑10 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處的OD值。②采用細胞免疫化學染色法檢測細胞中PCNA蛋白。將對數生長期32A、32A-C、siA、siA-C組細胞以及正常U251細胞(NC組)按照5×103/孔接種于96孔板中8 h后，分別加入100 μg/mL TMZ、0.15 mmol/mL H2O2以及600 mmol/mL乙醇，每組設置3個復孔。4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min；3% H2O2室溫孵育細胞10 min去除內源性過氧化物酶；0.5% TritonX-100冰上孵育20 min；10%胎牛血清室溫封閉1 h；加入一抗PCNA工作液后4 ℃過夜孵育；二抗(1)(反應增強液)以及二抗(2)(增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)于37 ℃分別孵育30 min；加入新鮮配制的DAB顯色。顯微鏡下觀察并拍照，Image J分析其積分光密度(IOD)值。

1.4 加入人pp32重組蛋白后U251細胞內HuR蛋白的檢測 采用細胞免疫組織化學染色以及Western blotting法。取對數生長期的U251細胞按照5×103/孔以及3×106個/孔分別接種于96以及6孔板中，培養(yǎng)12 h后分別加入終濃度為0、50 ng/mL的人pp32重組蛋白，每組設置3個復孔。培養(yǎng)48 h后，96孔板中的細胞用4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min；3% H2O2室溫孵育細胞10 min去除內源性過氧化物酶；0.5% TritonX-100冰上孵育20 min；10%胎牛血清室溫封閉1 h；加入一抗HuR(稀釋比例1∶200)后4 ℃過夜孵育；二抗(1)(反應增強液)以及二抗(2)(增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)于37 ℃分別孵育30 min；加入新鮮配制的DAB顯色，顯微鏡下觀察并拍照，觀察HuR在細胞核和細胞質中的定位。棄掉6孔板中細胞上清液，加入蛋白裂解液，行蛋白定量后用于上樣跑膠。恒電壓電泳，濃縮膠80 V，30 min；10%分離膠120 V電泳后，調節(jié)恒流300 mA轉膜1.5 h；5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h；一抗HuR(稀釋比例1∶1 000)以及actin(稀釋比例1∶1 000)4 ℃過夜孵育；HRP標記二抗(稀釋比例1∶5 000) 孵育1 h后；用ECL液在凝膠成像儀Image Quant LAS4000中顯影。將顯影好的內參與目的蛋白的條帶用Image J分析并記錄。目的蛋白灰度值/actin灰度值作為蛋白相對表達量。

2 結果

U251細胞穩(wěn)定轉染慢病毒后，在熒光顯微鏡下觀察，與NC U251細胞相比，32A、32A-C、siA和siA-C細胞顯示綠色熒光，病毒感染效率約90%，且細胞形態(tài)、活力均良好。NC、32A、32A-C、siA-C和siA組pp32蛋白相對表達量分別為0.231±0.001、0.248±0.009、0.530±0.045、0.253±0.007、0.113±0.015；與NC以及32A-C組相比，32A組細胞中pp32蛋白表達量高(t分別為-9.45、-8.73，P均<0.05)；與NC以及siA-C組相比，siA組細胞中pp32蛋白表達量降低(t分別11.02、14.12，P均<0.05)。說明pp32高/低表達U251細胞株構建成功。

2.1 加入TMZ、H2O2、乙醇后各組細胞增殖活性比較 與0、12 h相比，分別加入TMZ、H2O2以及乙醇24 h，U251細胞OD值降低(P均<0.05)。分別加入TMZ、H2O2以及乙醇24 h，與NC以及32A-C組相比，32A組細胞OD值升高；與NC以及siA-C組相比，siA-C組細胞OD值下降(P均<0.05)；詳見表1。與NC以及32A-C組相比，32A組細胞PCNA相對表達量增加(P均<0.05)；與NC以及siA-C組相比，siA組細胞PCNA相對表達量減少(P均<0.05)；詳見表2。

表1 分別加入TMZ、H2O2、乙醇后培養(yǎng)不同時間 各組細胞OD值

2.2 加入人pp32重組蛋白后，U251細胞中HuR蛋白的定位及其表達變化 加入0 ng/mL的人pp32重組蛋白后細胞核中的HuR表達多，加入50 ng/mL的人pp32重組蛋白后細胞質中的HuR表達多。Western blotting結果顯示，U251細胞中加入0、50 ng/mL人pp32重組蛋白后，細胞中HuR蛋白相對表達量分別為0.564±0.026、0.583±0.015，二者比較，t=-0.892，P>0.05；細胞質中HuR蛋白相對表達量分別為0.156±0.001、0.398±0.021，二者比較，t=-16.01，P<0.05。

表2 分別加入TMZ、H2O2、乙醇后各組細胞中PCNA蛋白 相對表達量

3 討論

酸性核磷蛋白32家族成員包括pp32、肝細胞生成素Cn、ANP32B等，是一類進化上高度保守的多功能蛋白，其功能涉及到細胞增殖、分化、凋亡以及細胞運動等多種不同的生物學事件[7～9]。其中，pp32發(fā)現(xiàn)最早，亦被命名為ANP32A，因其與腫瘤廣泛聯(lián)系，研究也最為深入。pp32可以抑制癌細胞凋亡、調節(jié)細胞骨架、激活增殖相關信號通路從而促進細胞遷移和癌細胞轉移等[10]，其主要作用機制:①可作為mRNA結合蛋白HuR的配體，參與mRNA的穩(wěn)定性，進而影響HuR蛋白在細胞核質之間的穿梭；②能夠與微管相關蛋白結合以及參與微管功能的調控，從而影響細胞內信號傳遞以及物質的運輸；③pp32作為乙酰轉移酶抑制劑因子復合物的主要組成部分，在調控組蛋白的乙?；?、磷酸化以及轉錄中起著重要作用；④可以抑制蛋白磷酸酶2A的生物活性等。前期研究[11]中，我們采用人多組織芯片分析結果顯示pp32呈多組織分布，而在腦組織中表達水平最高，并可能參與哺乳動物神經系統(tǒng)的發(fā)育過程。研究[12,13]表明，pp32在神經系統(tǒng)中行使重要的生物學功能，如pp32在胚胎腦組織中高表達，與腦組織發(fā)育有關；通過引起表觀遺傳改變調節(jié)神經元分化；在神經元細胞質中與微管結合蛋白結合，調節(jié)軸突形成；pp32降低與神經變性疾病脊髓小腦共濟失調有關；CXCL12/CXCR4刺激pp32表達升高，使其與Rb相互作用，保護興奮性毒素引起的神經元損傷。

膠質瘤是成人中樞神經系統(tǒng)中最常見原發(fā)性惡性腫瘤。一些頭顱損傷，化學藥物損傷如過氧化物、乙醇等，環(huán)境致癌物和飲食等均與膠質瘤發(fā)病有關[14],由于其呈彌漫性生長，并影響和侵襲正常腦組織，手術常難徹底切除，且術后放療效果欠佳[15]。TMZ是咪唑并四嗪類烷化劑抗腫瘤藥，易透過血腦屏障，為膠質瘤常見化療藥物。膠質瘤耐藥是TMZ化療失敗的主要原因[16]。已有研究表明，酸性核磷蛋白32家族成員參與調控腫瘤耐藥過程。在胰腺癌中，Williams等[3]發(fā)現(xiàn)，pp32高表達可選擇性引起胰腺癌細胞對化療藥物阿糖胞苷和吉西他濱耐藥，但卻對氟尿嘧啶敏感；Hostetter等[4]研究發(fā)現(xiàn)，pp32表達升高可引起乳腺癌細胞質中HuR累積，導致其對他莫昔芬耐藥。pp32可以通過上調Mcl-1等抗凋亡基因從而抑制多種化療藥物誘導的肝癌細胞凋亡[17]。

本研究通過加入H2O2和乙醇等化學毒物及TMZ對人pp32高/低表達U251細胞株進行誘導損傷，檢測pp32對損傷細胞增殖活性的影響,結果顯示，與0、12 h相比，分別加入TMZ、H2O2、乙醇24 h，U251細胞OD值降低；分別加入TMZ、H2O2、乙醇24 h，與NC、32A-C組比較，32A組細胞OD值升高，PCNA蛋白相對表達量增加;與NC、siA-C組比較，siA組細胞OD值降低，PCNA蛋白相對表達量減少。提示pp32蛋白可使替莫唑胺、H2O2、乙醇作用后的人膠質瘤細胞株U251增殖活性增強。

研究報道，HuR屬于RNA結合蛋白Hu家族成員，為核質穿梭蛋白，與多種腫瘤的發(fā)生、損傷保護以及耐藥相關。HuR三個特異性結構域與靶mRNA非翻譯區(qū)的1個或多個U-或AU-富集元件(AREs)結合，調節(jié)腫瘤相關基因(如血管內皮生長因子、Her-2等)mRNA轉運、穩(wěn)定和轉錄后翻譯，從而影響腫瘤發(fā)生與進展。多種含有AREs的腫瘤相關轉錄本，如原癌基因、細胞因子、生長因子和侵襲因子等均為HuR的靶基因。HuR參與腫瘤耐藥調控，HuR下調表達導致乳腺癌對柔紅比星誘導的細胞凋亡水平下降，柔紅比星耐藥的MCF-7細胞株中多藥耐藥相關三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G2轉運子高表達，而HuR及其調控靶基因表達明顯降低，恢復HuR表達則MCF-7細胞恢復對柔紅比星細胞毒的敏感性。HuR由細胞核向細胞質遷移，并在細胞質中裂解為活性狀態(tài)，與細胞毒性等致死性壓力應激造成的細胞凋亡有關，而HuR由細胞核向細胞質遷移是這一過程的限速步驟[18,19]，pp32作為HuR的適配子，參與調節(jié)HuR核質穿梭、mRNA轉運、細胞凋亡等生物學功能[20]。本研究結果顯示，pp32可以誘導HuR由細胞核向細胞質遷移。提示pp32可能通過促進膠質瘤細胞HuR從細胞核向細胞質轉移而增強膠質瘤細胞的增殖活性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，pp32蛋白可使替莫唑胺、H2O2、乙醇作用后的人膠質瘤細胞株U251增殖活性增強，其作用可能與促進HuR從細胞核向細胞質轉移有關。提示pp32可能通過調節(jié)HuR等蛋白表達和生物學功能，進而參與調控膠質瘤進展、細胞損傷保護以及耐藥，其具體調控機制有待進一步研究。