陳姝璇，康楊婷，石海燕，伍國鋒，王麗琨

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽550004)

癲癇是多種原因?qū)е碌哪X部神經(jīng)元高度同步化異常放電的臨床綜合征，以反復(fù)的自發(fā)性發(fā)作為主要特征。約有30%的癲癇患者經(jīng)過系統(tǒng)正規(guī)的藥物治療，仍不能得到有效控制，成為耐藥性癲癇,耐藥性癲癇反復(fù)發(fā)作會給患者心理、認知等方面帶來嚴重的負面影響，同時也增加患者的病死率[1,2]。有研究顯示，癲癇的發(fā)生可能是由于神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性遞質(zhì)和興奮性遞質(zhì)的不平衡引起的。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元激發(fā)的調(diào)控主要是通過抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)進行，GABA與GABA受體結(jié)合后可發(fā)揮抑制作用。GABA受體分為離子型GABAA受體和代謝型GABAB受體。GABAA受體可介導(dǎo)抑制性突觸后電流從而對癲癇發(fā)作產(chǎn)生抑制作用[3,4]。GABAB受體可調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和遲發(fā)性抑制性突觸后電位，在控制癲癇的興奮性方面起重要作用[5]。目前，GABA受體與癲癇耐藥是否有關(guān)仍未明確。2014年9月～2017年7月，我們建立了耐藥性顳葉癲癇大鼠模型， 觀察了GABA受體表達變化。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級健康成年雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量200～250 g,日齡50～60 d，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗前將動物置于實驗室1周適應(yīng)環(huán)境，單籠喂養(yǎng)，自由進食和飲水，室溫21～25 ℃，自然采光，無自發(fā)性癲癇發(fā)作的大鼠入選。BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)、DW-2000腦立體定向儀、HF30型可拆式屏蔽室(中國成都泰盟科技有限公司)，苯妥英鈉(中國武漢遠城科技發(fā)展有限公司)，苯巴比妥鈉(中國上海新亞藥業(yè)有限公司)，小型垂直電泳槽、全濕電轉(zhuǎn)印裝置、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國加州Bio-Rad公司)，Anti-GABAA antibody、Anti-GABAB antibody(美國Abcam公司)，HRP-RAbbit Anti-Chicken IgY(IgG)、PV6001-3ml 兔kit、TRIS、酶標條12孔、SDS、甲醇(中國北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)。

1.2 耐藥性顳葉癲癇模型的建立及鑒定 氯化鋰125 mg/kg腹腔注射，18～24 h后給予硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min后首劑腹腔注射匹羅卡品30 mg/kg，30 min后若無Racines分級[6]Ⅳ級以上發(fā)作，可每隔30 min注射10 mg/kg追加劑量，直至出現(xiàn)Ⅳ級以上無明顯間歇的癲癇持續(xù)狀態(tài)。注射匹羅卡品后，若大鼠反復(fù)出現(xiàn)IV～V級發(fā)作視為大發(fā)作，即氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型建立成功。氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型建立成功2周后，給予苯巴比妥25 mg/kg，1次/d,連續(xù)給予2周，然后記錄大鼠癲癇發(fā)作頻率及持續(xù)時間。若用藥后癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時間減少≥50%為對苯巴比妥敏感，即藥物敏感癲癇大鼠；若氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型大鼠癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時間減少<50%為對苯巴比妥耐藥的癲癇大鼠，此時需選擇第2種抗癲癇藥苯妥英鈉75 mg/kg，1次/d,連續(xù)給予2周；若癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時間減少<50%為對苯妥英鈉耐藥，對苯巴比妥和苯妥英鈉均耐藥的大鼠為耐藥型大鼠[7]。本研究中SD大鼠60只，成功建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型25只，使用苯巴比妥和苯巴比妥耐藥性篩選后篩選出藥物敏感16只，耐藥癲癇大鼠9只。用隨機數(shù)字法從敏感大鼠中選取8只作為藥物敏感組，從耐藥大鼠中選取8只作為耐藥組，再選擇8只正常SD大鼠作為對照組。觀察、記錄并分析各組大鼠癲癇發(fā)作程度、發(fā)作級別，并將各組癲癇大鼠的大腦右側(cè)海馬植入電極，連接于腦電圖記錄儀，觀察并記錄腦電圖的頻率、波幅變化。藥物敏感組癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作級別、發(fā)作持續(xù)時間分別為(1.43±1.10)次、(2.63±0.52)級、(35.38±2.92)s，耐藥組分別為(3.96±1.12)次、(4.88±0.35)級、(66.75±5.73)s。與藥物敏感組比較，耐藥組癲癇發(fā)作次數(shù)增加，發(fā)別級別升高，發(fā)作持續(xù)時間延長(P均<0.05)。腦電圖提示典型的癲癇波型有單棘波、多相棘波、雙相棘波、棘慢波、陣發(fā)性高幅尖波節(jié)律，其中以多發(fā)棘波為主且頻繁出現(xiàn)。耐藥組發(fā)作前以快波和單棘波為主，發(fā)作前、發(fā)作時癲癇波頻率、波幅及發(fā)作后波幅高于藥物敏感組(P均<0.05)，見表1。以上結(jié)果提示耐藥性顳葉癲癇模型建立成功。

表1 癲癇發(fā)作前、中、后兩組腦電圖癲癇波頻率、 波幅比較

注：與藥物敏感組同時間相比，＊P<0.05。

1.3 三組海馬組織GABAA受體和GABAB受體的檢測 ①采用免疫組織化學(xué)染色法檢測海馬組織GABAA受體、GABAB受體。10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射大鼠，待大鼠麻醉后應(yīng)用冷生理鹽水及4%多聚甲醛灌注，取含有海馬結(jié)構(gòu)的2～3 mm厚冠狀切面腦組織，固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、脫蠟、水化，于3%過氧化氫室溫孵育10 min，PBS沖洗3次×5 min，后選用乙二胺四乙酸二鈉修復(fù)抗原，待冷卻后給予PBS沖洗3次×5 min，滴入正常山羊血清工作液，室溫孵育10 min，傾去血清，滴加一抗，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次×5 min，每張片加入50 U二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次×5 min，每張片加DAS染色液100 μL，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。以細胞膜或細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)者判定陽性細胞。PBS代替一抗為陰性對照。利用MIAS圖像分析系統(tǒng)在400倍視野下每張切片選擇5處陽性細胞測定其平均光密度值(MOD)。②采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測海馬組織GABAA受體、GABAB受體。將大鼠麻醉后斷頭取腦，取出海馬組織放入研磨器，加入裂解液和PMSF(終濃度為1 mmol/L),充分勻漿后，4 ℃、120 000 r/min離心15 min取上清，蛋白定量后，加入5×上樣緩沖液混勻，將其置入沸水中，煮沸5 min，使蛋白變性。用移液器將按比例配好的8%的分離膠10 mL緩慢加入制膠板中，避免氣泡產(chǎn)生，再將5%的濃縮膠灌于玻璃板中，立即將干凈的梳子插入濃縮膠。每例蛋白樣品按4∶1的比例在樣品中加入4×加樣緩沖液，加入蛋白質(zhì)Marker，初電壓80 V電流強度進行電泳，至分離線后調(diào)電壓至120 V，當(dāng)目的蛋白泳動至距膠下緣1 cm以上結(jié)束。將濾紙、PVDF膜切成與凝膠尺寸大小一致，用兩張大濾紙貼于兩張多孔墊料，將PVDF膜夾于中間成三明治結(jié)構(gòu)，4 ℃、250 mA恒流轉(zhuǎn)移2 h。PVDF膜用PBS沖洗15 min×2次，封閉液中搖蕩1 h后用TBST洗3遍，加入一抗4 ℃過夜后用TBST洗3遍。過夜后孵育二抗1 h,洗膜5 min×3次,將發(fā)光液A和發(fā)光液B按1∶1比例混勻倒在PVDF膜上，發(fā)光液蓋住膜即可，曝光。蛋白質(zhì)免疫印跡法所檢測的蛋白條帶采用Image J測量軟件分析，計算累計光密度(IOD)值,采用目的條帶的IOD值/對應(yīng)的內(nèi)參(β-actin，GAPDH)IOD值得出IOD比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

免疫組化染色法檢測海馬組織GABAA受體、GABAB受體結(jié)果顯示，對照組大鼠海馬組織的細胞膜和細胞質(zhì)可見大量棕黃色或棕褐色GABAA受體顆粒，顏色深；藥物敏感組仍可見大量棕褐色GABAA受體顆粒，但較對照組少；耐藥組僅可見少量棕褐色GABAA受體顆粒(圖1)。對照組大鼠海馬組織的細胞核和細胞質(zhì)可見大量棕黃色或棕褐色GABAB受體顆粒，顏色深；敏感組仍可見大量棕褐色GABAB受體顆粒，但較對照組少；耐藥組僅可見少量棕褐色GABAB受體顆粒(圖2)。三組GABAA、GABAB受體MOD值、IOD值比較見表1。

表1 三組海馬組織GABAA、GABAB受體表達比較

注：與對照組比較，#P<0.05，與藥物敏感組比較，*P<0.05。

圖1 三組GABAA受體的表達(免疫組化法)

圖2 三組GABAB受體的表達(免疫組化法)

圖3 三組GABAA受體和GABAB受體的表達

3 討論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其臨床表現(xiàn)為抽搐發(fā)作，具有反復(fù)發(fā)作和不可預(yù)測性，然而，目前癲癇及耐藥性癲癇的病因大多未可知[7，8]。應(yīng)用動物癲癇模型及大量的動物實驗來揭開耐藥性癲癇的病因及本質(zhì)為目前研究癲癇的主要方法。本研究中應(yīng)用氯化鋰-匹羅卡品成功建立癲癇大鼠模型，該模型操作較方便，可直觀觀察記錄用藥前后癲癇發(fā)作時間、發(fā)作頻率、發(fā)作次數(shù)等指標以觀察癲癇大鼠對抗癲癇藥物的反應(yīng)性，適合于臨床藥物篩選的研究，也可用于研究癲癇發(fā)作的機制[9]，是較理想動物癲癇模型。本研究中，在癲癇發(fā)作時，耐藥組及藥物敏感組癲癇大鼠均有腦電圖改變，可見棘波、尖波、尖慢波等癲癇樣波，提示顳葉癲癇模型建立成功。

只有在普通癲癇模型的基礎(chǔ)上經(jīng)過作用機制不同的2種抗癲癇藥物治療足夠時間，仍然無效才能認為是耐藥性癲癇模型。Bethmann等[10]用苯巴比妥及苯妥英鈉對杏仁核點燃癲癇大鼠模型進行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對苯巴比妥耐藥的癲癇大鼠中，80%左右對苯妥英鈉也耐藥。這兩種抗癲癇藥物是作用機制完全不同的一線抗癲癇藥，苯巴比妥作用于γ-GABA受體，激活氯離子通道導(dǎo)致突觸后模超極化，從而抑制突觸后神經(jīng)元的活動；而苯妥英鈉為鈉通道阻滯劑，阻斷鈉離子內(nèi)流從而抑制癲癇病灶內(nèi)神經(jīng)元的激活。本研究中我們也選用此兩種藥物作為耐藥性癲癇的篩選，成功建立了耐藥性顳葉癲癇模型。本研究結(jié)果顯示，與藥物敏感組比較，耐藥組癲癇發(fā)作次數(shù)增加、發(fā)別級別升高、發(fā)作時間延長。耐藥組發(fā)作前癲癇波(發(fā)作前主要以快波和單棘波為主)頻率，發(fā)作時頻率、波幅及發(fā)作后波幅高于藥物敏感組，提示耐藥癲癇模型成功建立。

在癲癇發(fā)病機制中，一致的觀點是癲癇腦組織內(nèi)存在興奮功能與抑制功能的病理性失衡，即以谷氨酸為代表的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能增強或以GABA為代表的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能減弱[11]。在癲癇患者與癲癇動物的腦組織中存在GABA抑制性中間神經(jīng)元的丟失[12]以及GABAA受體介導(dǎo)的抑制性神經(jīng)元的紊亂[13]，癲癇發(fā)作與GABA的釋放、免疫活動和結(jié)合位點的變化相關(guān)。GABAA受體受癲癇持續(xù)狀態(tài)的影響而發(fā)生改變。研究[14]發(fā)現(xiàn)，急性期癲癇發(fā)作能抑制GABAA受體的功能，GABAA受體的拮抗劑有助于誘導(dǎo)癲癇的發(fā)作，而能提高GABAA神經(jīng)傳遞功能的藥物則具有抗驚厥作用。GABAB受體也參與了癲癇活動 ，在癲癇動物的海馬中，GABAB受體減少[15]，缺乏GABAB受體的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出全身性癲癇發(fā)作活動，GABAB受體拮抗劑可誘發(fā)或加重癲癇發(fā)作活動[16]。在癲癇患者的海馬中GABAB受體在突觸前降低，改變突觸前后神經(jīng)細胞抑制性突觸后電位[17]，從而誘發(fā)癲癇發(fā)作。

癲癇耐藥的重要原因之一為治療靶點對抗癲癇藥物失去反應(yīng)性。GABA受體門控氯離子通道在癲癇耐藥的發(fā)生發(fā)展中作用突出，腦細胞外液GABA含量減少可以觸發(fā)癲癇發(fā)作并維持癲癇狀態(tài)存在[18]，增強GABA系統(tǒng)的功能是難治性癲癇治療的重要策略。GABAA受體在腦內(nèi)主要由2個α1、2個β2和1個γ2亞基組成。改變GABAA受體亞型,比如α1、α5、γ2可能與抗癲癇藥物的耐藥密切相關(guān)[19]，且GABAA受體可能是耐藥性癲癇治療的靶點[20]。GABAA受體γ2亞基被認為是苯二氮唑類藥物的作用靶點[21]，其被證明與癲癇發(fā)作、神經(jīng)退化及抗癲癇藥物的耐藥密切相關(guān)[22]。 本研究表明，與藥物敏感組比較，耐藥組癲癇大鼠癲癇發(fā)作級別升高，持續(xù)時間延長及發(fā)作次數(shù)增加，海馬組織GABAA和GABAB受體表達降低，可能是耐藥性癲癇大鼠腦組織中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABAA、GABAB受體降低，導(dǎo)致GABAA和GABAB受體介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性作用減弱，促進癇性反復(fù)發(fā)作。

綜上所述，在耐藥性癲癇大鼠海馬組織中GABAA受體和GABAB受體表達降低，癲癇發(fā)作明顯加重，提示GABA受體可能參與了癲癇發(fā)生耐藥的機制。本文不足之處在于僅發(fā)現(xiàn)了在耐藥性癲癇中GABAA和GABAB受體降低，但并沒有探討其降低的原因及引起耐藥性癲癇的機制，有待進一步探討。