劉文婷,楊菁

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖中心,武漢430060)

體外受精是指在體外環(huán)境中將成熟卵子和精子在人工控制環(huán)境下相互作用并結(jié)合成受精卵的過程。根據(jù)精子和卵子孵育時間以及精子進(jìn)入卵子內(nèi)部方式可將體外受精分為常規(guī)體外受精、短時體外受精、ICSI授精以及補(bǔ)救ICSI授精等。目前最常見體外受精方式為常規(guī)體外受精(IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)。國內(nèi)已有學(xué)者對兩種受精方式的囊胚形成率及妊娠結(jié)局進(jìn)行了比較，認(rèn)為在同樣的選擇性囊胚培養(yǎng)納入標(biāo)準(zhǔn)下,相比于ICSI,接受IVF者囊胚形成率和胚胎利用率更高[1],但由于沒有考慮到IVF與ICSI兩種受精方式在精液參數(shù)上存在明顯差異，無法排除因精液參數(shù)的差異而導(dǎo)致不同受精方式囊胚培養(yǎng)結(jié)局的差異。本研究中，我們除了根據(jù)受精方式不同進(jìn)行分組以外，并根據(jù)精液參數(shù)的不同將ICSI進(jìn)一步分為正常精液與少弱精子精液亞組，比較不同受精方式的囊胚培養(yǎng)結(jié)局及凍融囊胚移植妊娠結(jié)局，以探討不同受精方式對囊胚培養(yǎng)結(jié)局及妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2017年12月在湖北省婦幼保健院生殖中心接受常規(guī)體外受精(IVF)/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的女性受者1 230例。納入標(biāo)準(zhǔn):女方年齡≤35歲；可獲取新鮮的卵子和精液者；囊胚培養(yǎng)第3天(D3)可利用胚胎數(shù)≥6(可利用胚胎為卵裂球數(shù)目≥4,且碎片≤25%)且未行胚胎冷凍；凍融周期囊胚移植者。排除標(biāo)準(zhǔn):卵巢功能異常者；精液來源于附睪穿刺取精和睪丸穿刺取精者；行新鮮周期囊胚移植者。按受精方式不同分為IVF組994例、ICSI組236例，ICSI組按照精液參數(shù)的不同分為ICSI正常精液組90例、ICSI少弱精組146例。IVF組平均年齡29.27歲、平均不孕年限2.92年、平均獲卵數(shù)20.24個、平均囊胚移植數(shù)1.86個、平均治療周期數(shù)1.13個、平均BMI 25.56 kg/m2、平均基礎(chǔ)卵泡刺激激素(FSH)6.12 IU/L，ICSI少弱精組組平均年齡29.11歲、平均不孕年限3.04年、平均獲卵數(shù)21.89個、平均囊胚移植數(shù)1.83.個、平均治療周期數(shù)1.16個、平均BMI 1.93 g/m2、平均FSH 5.88 IU/L，ICSI正常精液組平均年齡30.38歲、平均不孕年限3.02年、平均獲卵數(shù)18.22個、平均囊胚移植數(shù)1.81個、平均治療周期數(shù)1.24個、平均BMI 22.14 kg/m2、平均FSH 6.14 IU/L。三組年齡、獲卵數(shù)、囊胚移植數(shù)、治療周期數(shù)、不孕年限、BMI以及基礎(chǔ)FSH比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

1.2 卵子、精子的提取及體外受精 卵子的提取:當(dāng)患者一半以上卵泡直徑≥14 mm時，于當(dāng)晚注射重組HCG，36 h后陰道超聲引導(dǎo)下 取卵。精子的提取:入選患者均禁欲3～7 d,收集手淫當(dāng)日新鮮精液；IVF患者采用密度梯度離心法洗滌，后通過上游法收集上層精子，在授精皿中調(diào)至合適濃度待授精。ICSI組的顯微注射均由高年資經(jīng)驗豐富的工作人員操作，排除因人員技術(shù)對胚胎發(fā)育的影響。ICSI少弱精患者因精子參數(shù)差為保證獲得足夠的精子，采用微量梯度離心法或直接離心法。ICSI正常精液組采用密度梯度離心法洗滌后，利用精子自身運(yùn)動上游將活動的精子從精液中分離出來。授精:IVF組在HCG注射后39～40 h內(nèi)完成授精，ICSI少弱精組和ICSI正常精液組取卵后3～4 h用80 IU/mL的透明質(zhì)酸酶去除卵丘顆粒細(xì)胞，將排出第一極體的成熟卵子行ICSI。授精16～18 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察受精情況，出現(xiàn)雙原核視為正常受精。根據(jù)Peter卵裂期胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)評估D3胚胎質(zhì)量,優(yōu)胚為D1出現(xiàn)雙原核，D2卵裂球數(shù)目2～5個，D3卵裂球數(shù)目≥6個且碎片≤10%。

1.3 囊胚培養(yǎng)及移植 將符合囊胚培養(yǎng)患者(年齡≤35歲；D3可利用胚胎數(shù)≥6)的胚胎采用序貫培養(yǎng)基(SAGE)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)至第5～6天，按Gardner囊胚分級系統(tǒng)對囊胚進(jìn)行分級，然后冷凍囊胚。根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵出將囊胚的發(fā)育分為6個時期:1期:早期有腔室囊胚，囊胚腔體積小于胚胎總體積的1/2；2期:囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2；3期:擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期:囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5期:正在孵出，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期:孵出囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。處于3～6期的囊胚，還需對其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行分級。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級:A級:細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密；B級:細(xì)胞數(shù)目少，排列松散；C級：細(xì)胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層分級:A級:上皮細(xì)胞層有較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B級:上皮細(xì)胞層由不多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C級:上皮細(xì)胞層由稀疏的細(xì)胞組成，大細(xì)胞很少。將D5或D6評分3AA、3BA、3AB、4AA、4BA、4AB的囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。囊胚移植:采用玻璃化試劑(KITAZATO)解凍囊胚，凍融囊胚復(fù)蘇后在囊胚培養(yǎng)液中培養(yǎng)至少2 h，能重新擴(kuò)張成正常內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和正常外滋養(yǎng)層形態(tài)的囊胚視為存活。將待移植囊胚移入移植皿，用培養(yǎng)液潤洗移植內(nèi)管，鏡下不超過20 μL培養(yǎng)液裝胚胎。由實驗室工作人員將移植管移交給臨床醫(yī)生，在腹部B超引導(dǎo)下進(jìn)行胚胎移植。對于移植囊胚后妊娠者給予黃體酮支持10～12周。

1.4 胚胎質(zhì)量、囊胚培養(yǎng)及臨床妊娠結(jié)局的觀察 ①胚胎質(zhì)量參數(shù)(包括正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率):IVF正常受精率=(D1出現(xiàn)2PN及2PB卵子數(shù))/IVF加精卵子總數(shù)×100%;ICSI正常受精率=(D1出現(xiàn)2PN及2PB卵子數(shù))/注射MⅡ卵子總數(shù)×100%;卵裂率=D2卵裂胚胎數(shù)/正常受精卵子數(shù)；優(yōu)胚率=優(yōu)胚數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%。②囊胚培養(yǎng)結(jié)局(囊胚形成率、胚胎種植率):囊胚形成率=(D5/6總囊胚數(shù))/正常受精卵子數(shù)×100%；胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。③臨床妊娠結(jié)局:臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。妊娠結(jié)局判定:囊胚移植14 d檢測尿、血HCG陽性為生化妊娠，囊胚移植28 d B超見孕囊為臨床妊娠。

2 結(jié)果

共納入1 230個取卵周期，IVF組994個，ICSI組236個,其中ICSI正常精液組90個、ICSI少弱精組146個。

2.1 三組胚胎質(zhì)量參數(shù)比較 三組正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率比較，P均>0.05,見表1。排除D3養(yǎng)囊胚前因胚胎質(zhì)量差異導(dǎo)致的囊胚形成率的差異。

表1 三組胚胎質(zhì)量參數(shù)

2.2 三組囊胚培養(yǎng)結(jié)局及臨床妊娠結(jié)局比較 IVF組囊胚形成率高于ICSI少弱精組和ICSI正常精液組(P均<0.01)；ICSI少弱精組和ICSI正常精液組囊胚形成率比較，P>0.05。三組胚胎種植率、臨床妊娠率比較,P均>0.05,見表2。

表2 三組囊胚形成率、胚胎種植率及臨床妊娠率

3 討論

相比于ICSI，IVF的受精方式更接近自然受精過程，精子和卵子通過自然篩選和選擇結(jié)合在一起，能與卵子自然結(jié)合的精子在DNA的完整性上優(yōu)于不能與卵子結(jié)合的精子[2]。ICSI讓男性不育癥，特別少弱畸精癥的患者或常規(guī)IVF不受精，或受精率很低的患者得到有效治療，但是這種受精方式失去了自然選擇過程。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，ICSI授精顯微鏡下人為選擇活力和形態(tài)學(xué)正常的精子在染色體和DNA碎片上也可能存在一定異常。也有研究[4]表明，精子DNA碎片與IVF/ICSI早期胚胎發(fā)育顯著相關(guān)，精子DNA碎片越高、IVF/ICSI結(jié)局也越差。精子本身的缺陷有可能導(dǎo)致卵裂期胚胎在4-8細(xì)胞發(fā)育階段以及囊胚發(fā)育階段發(fā)育緩滯[5]。本研究中ICSI少弱畸精組和ICSI正常精液組優(yōu)胚率、囊胚形成率、臨床妊娠率及胚胎種植率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示在我們在現(xiàn)有的技術(shù)條件下行ICSI，通過顯微鏡挑選形態(tài)學(xué)正常的精子，可降低精液參數(shù)差異導(dǎo)致的胚胎發(fā)育障礙風(fēng)險，但本研究也有自身的局限性，在納入標(biāo)準(zhǔn)中能達(dá)到囊胚培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的患者，并未包含極端形態(tài)異常致無法挑選出正常形態(tài)精子的特殊患者。

囊胚培養(yǎng)是在適宜的培養(yǎng)條件下，延長體外胚胎培養(yǎng)至第5～6天的囊胚階段。囊胚培養(yǎng)能篩選更有潛力的胚胎,且囊胚期移植與子宮內(nèi)膜發(fā)育更同步、有更低的異位妊娠率、更好的抗凍能力以及有利于胚胎植入前遺傳學(xué)診斷等諸多優(yōu)勢。已有研究[6～9]表明，囊胚培養(yǎng)可篩選出發(fā)育潛能較好的胚胎，且囊胚期移植更接近生殖內(nèi)膜環(huán)境，顯著提高了胚胎種植率。囊胚期移植的優(yōu)勢也很明顯，選擇高質(zhì)量的囊胚進(jìn)行移植可顯著提高胚胎種植率及臨床妊娠率。囊胚培養(yǎng)也有不足之處，要求條件高，有可能因為實驗室培養(yǎng)條件或胚胎自身原因，胚胎停止發(fā)育或退化，導(dǎo)致沒有胚胎可移植。由于體外培養(yǎng)環(huán)境終究不是體內(nèi)自然環(huán)境，延長培養(yǎng)時間也可能使一部分能夠著床的卵裂期胚胎退化。目前大多數(shù)生殖中心根據(jù)受者年齡、治療周期數(shù)、受精數(shù)、獲卵數(shù)和D3優(yōu)胚數(shù)等指標(biāo)以及自身意愿綜合考慮是否進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，以提高囊胚形成率，但受精方式對于囊胚培養(yǎng)結(jié)局是否有影響還未有定論。汪彩珠等[1]研究報道，選擇IVF授精方式的受者比選擇ICSI授精方式的受者有更高的囊胚形成率。本研究結(jié)果顯示，IVF組、ICSI正常精液組2PN受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率及胚胎種植率均無統(tǒng)計學(xué)差異，但囊胚形成率卻有統(tǒng)計學(xué)差異。提示，接受不同受精方式的受者囊胚形成率有差異，這個差異可能與體外不同受精方式的操作過程有關(guān)，具體原因考慮如下:ICSI操作會增加選擇DNA受損精子和侵入外源性物質(zhì)(PVP或者培養(yǎng)液)及垂直傳遞親代遺傳缺陷的風(fēng)險[10～12]；ICSI在操作過程中對卵母細(xì)胞的微管、微絲系統(tǒng)和紡錘體可能產(chǎn)生機(jī)械損傷[13,14]；ICSI受精會增加超微結(jié)構(gòu)異常及內(nèi)部DNA微缺失的精子注入卵母細(xì)胞的風(fēng)險，雖然這項操作并不影響卵子受精，但可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育緩滯影響囊胚形成[15～17]；當(dāng)精子DNA碎片率小于8%時，卵子可自行修復(fù)，但超過這個范圍將會影響胚胎的發(fā)育潛能[18]。

總之，接受不同授精方式的受者囊胚形成率有差異，妊娠結(jié)局類似。至于授精方式對于囊胚培養(yǎng)結(jié)局及妊娠結(jié)局是否有影響，需要進(jìn)一步進(jìn)行多因素回歸分析及更多的臨床研究證實。