鐘敏,蘇群豪，胡敏，徐璐，陶石

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,?？?70102)

重型再生障礙性貧血(SAA)是一組因造血干細(xì)胞損傷導(dǎo)致的骨髓衰竭性疾病[1]。研究證實(shí)，SAA的免疫發(fā)病機(jī)制主要為細(xì)胞免疫功能持續(xù)異常、自身免疫耐受失調(diào)，導(dǎo)致造血干細(xì)胞凋亡[2]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)被認(rèn)為在SAA發(fā)病中起了極為重要作用[3]。由于Treg能顯著調(diào)節(jié)免疫，有效抑制自身免疫反應(yīng)，維持機(jī)體免疫平衡，因此多種自身免疫疾病發(fā)病過(guò)程中均存在Treg數(shù)量或功能異常。臨床研究[4]證實(shí)，Treg參與SAA發(fā)病，然而Treg以及其他T淋巴細(xì)胞亞群與SAA患者的預(yù)后是否存在相關(guān)性仍未明確[5]。本研究觀察了初發(fā)SAA及緩解期SAA患者Treg細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞亞群百分比變化，并探討了Treg與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2017年7月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的SAA患者66例，均符合張之南等編纂的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]。男34例、女32例，年齡32～64(49.6±14.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的Coomb′s試驗(yàn)為陰性；臨床資料齊全，且按照醫(yī)囑隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn):合并有嚴(yán)重的心、肺、肝、腎等重要器官功能不全；罹患其他血液系統(tǒng)性疾病；近期6個(gè)月內(nèi)使用皮質(zhì)類(lèi)固醇激素及免疫抑制劑者。66例SAA患者中，新發(fā)30例(新發(fā)組)，其中男18例、女12例，年齡(54.2±13.4)年,有糖尿病史6例、高血壓史8例；SAA經(jīng)免疫抑制劑初治后恢復(fù)(恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn):血象恢復(fù)，網(wǎng)織紅細(xì)胞≥20×109/L，血小板≥20×109/L，ANC≥1.0×109/L；骨髓增生活躍，紅系及粒系的比例恢復(fù)正常，巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)≥8個(gè)/HP；不需要輸血治療)的患者36例(緩解組)，其中男16例、女20例，年齡(48.3±14.2)歲，有糖尿病史12例、高血壓史16例。兩組年齡、性別、既往病史等有可比性。

1.2 外周血中Treg、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞檢測(cè) 兩組均在納入研究后第2天清晨空腹取肘靜脈血3～5 mL，加入EDTA抗凝。采用FACS Canto Ⅱ型流式細(xì)胞儀(購(gòu)自美國(guó)BD公司)分別檢測(cè)各組患者外周血中Treg及CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分比，并計(jì)算CD4+T/CD8+T、Treg/CD4+T。

1.3 血清Treg分泌的細(xì)胞因子IL-10、IL-35、TGF-β檢測(cè) 應(yīng)用細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，再依據(jù)免疫磁珠儀使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Treg分選，將分選好的Treg以1×106/L濃度接種于24孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔中加5 mg/mL濃度的植物血凝素予以5%的CO2環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜后，收集各組上清液，均應(yīng)用ELISA法檢測(cè)IL-10、IL-35以及TGF-β。

1.4 隨訪 兩組研究對(duì)象出院后均予以電話或門(mén)診隨訪，隨訪時(shí)間為4～12個(gè)月、中位隨訪時(shí)間10個(gè)月。隨訪期間記錄患者血象、Treg及CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分比、并發(fā)癥等主要指標(biāo)，隨訪結(jié)局為死亡或急性復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn):骨髓細(xì)胞增生程度小于正常25%；血象具備三項(xiàng)中兩項(xiàng)，如網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)數(shù)<20×109/L、血小板絕對(duì)數(shù)<20×109/L、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值<0.5×109/L。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血Treg、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分比比較及其之間的相關(guān)性 與新發(fā)組相比，緩解組Treg百分比、CD8+T細(xì)胞及Treg/CD4+T高，CD4+T細(xì)胞百分比及CD4+T/CD8+T均低(P均<0.05)，見(jiàn)表1。SAA患者Treg百分比與CD4+T細(xì)胞、CD4+T/CD8+T呈負(fù)相關(guān)(r=-0.689，P=0.035；r=-0.724，P=0.029)，與網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比呈正相關(guān)(r=0.667，P=0.038)。

表1 兩組外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及Treg百分比

2.2 兩組血清IL-10、IL-35以及TGF-β水平比較 緩解組血清IL-10、IL-35及TGF-β水平高于新發(fā)組(P均<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組血清IL-10、IL-35以及TGF-β水平

組別nIL-10IL-35TGF-β新發(fā)組30157.9±22.259.4±7.965.5±9.6緩解組36181.3±29.565.3±8.772.6±8.4

2.3 SAA患者預(yù)后相關(guān)因素 66例SAA患者隨訪期間死亡22例、急性復(fù)發(fā)14例。以SAA患者預(yù)后為應(yīng)變量，將外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Treg、CD4+T/CD8+T、Treg/CD4+及血清IL-10、IL-35以及TGF-β水平為自變量，應(yīng)用全模型多元Logistic回歸分析方法進(jìn)行回歸分析，結(jié)果顯示Treg及Treg/CD4+T與SAA預(yù)后有關(guān)(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 SAA患者預(yù)后相關(guān)因素多元Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

盡管SAA具體的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，但是眾多臨床研究證實(shí)SAA是一種CD4+T細(xì)胞功能亢進(jìn)的自身免疫疾病，T淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量、表型以及免疫功能的變化為該病主要發(fā)病機(jī)制[1，6]。CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加，CD4+T、CD8+T細(xì)胞比例失衡引起免疫偏移，致使造血微環(huán)境調(diào)節(jié)因子失調(diào)，最終導(dǎo)致造血功能衰竭[7，8]，而調(diào)節(jié)CD4+T、CD8+T細(xì)胞免疫平衡的關(guān)鍵因素是Treg。研究證實(shí)，Treg是一類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)作用的CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞亞群，能有效抑制CD4+T細(xì)胞增殖，減少炎性細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而維持自身免疫耐受[9,10]。研究[3,9～12]表明，SAA患者外周血循環(huán)中Treg數(shù)量和功能均存在顯著異常。Kordasti等[10]研究發(fā)現(xiàn)，SAA患者Treg數(shù)量低于輕型再生障礙性貧血患者以及正常人群，并且正常人群CD4+T細(xì)胞功能不能被SAA患者Treg所抑制。但是，目前研究重點(diǎn)為SAA患者體內(nèi)Treg分布及對(duì)其他T細(xì)胞亞群的影響，尚未有臨床報(bào)道Treg與SAA患者預(yù)后的關(guān)系[13]。本研究通過(guò)觀察SAA患者外周血Treg和CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分比的變化，并探討了其與預(yù)后的相關(guān)性，以此為臨床進(jìn)一步改善SAA患者預(yù)后提供循證依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，SAA患者存在T細(xì)胞免疫異常，初治期SAA患者體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞、CD4+T/CD8+T高于緩解期患者，而CD8+T細(xì)胞低于緩解期患者，與既往研究[14,15]結(jié)果一致，表明SAA患者CD4+T細(xì)胞占主導(dǎo)地位，免疫平衡向正向調(diào)控偏移，促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖與分化；初治期SAA患者Treg百分比及Treg/CD4+T低，提示SAA患者體內(nèi)Treg的數(shù)量及功能均被抑制，沒(méi)能起到免疫調(diào)節(jié)功能。國(guó)外研究[16,17]顯示，SAA發(fā)病機(jī)制中主要環(huán)節(jié)為T(mén)reg百分比降低，并且Treg百分比與SAA患者病情程度呈正相關(guān)，監(jiān)測(cè)Treg水平能有效評(píng)估SAA患者病情變化。進(jìn)一步研究[18,19]分析顯示，初治期患者體內(nèi)血清的IL-10、IL-35以及TGF-β水平低，而這些細(xì)胞因子均是Treg分泌的主要細(xì)胞因子，能顯著抑制CD4+T細(xì)胞活性，提示SAA患者體內(nèi)的Treg免疫功能被顯著抑制。對(duì)SAA患者體內(nèi)Treg百分比與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示Treg百分比與CD4+T細(xì)胞百分比及CD4+T/CD8+T呈負(fù)相關(guān)，與網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比呈正相關(guān)，提示SAA患者體內(nèi)Treg數(shù)量和造血系統(tǒng)恢復(fù)有較強(qiáng)相關(guān)性，其中的具體調(diào)控機(jī)制值得繼續(xù)進(jìn)行深入研究。進(jìn)一步應(yīng)用多元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示Treg百分比及Treg/CD4+T與SAA預(yù)后有關(guān)，表明升高Treg百分比及Treg/CD4+T可能可有效改善SAA患者預(yù)后。

綜上所述，與緩解期SAA患者比較，新發(fā)SAA患者外周血Treg百分比降低。外周血Treg百分比升高提示SAA患者預(yù)后良好。Treg細(xì)胞及Treg/CD4+T可用于監(jiān)測(cè)SAA患者細(xì)胞免疫功能、評(píng)估臨床預(yù)后。然而本研究的納入病例較少，故此結(jié)論仍需要大樣本多中心的臨床試驗(yàn)來(lái)證實(shí)。