楊忠敏，王祖文，沈以紅，丁曉雯，黃先智*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400716) 2(西南大學(xué) 蠶學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)研究所，重慶，400716)

在機(jī)體內(nèi)，抗氧化防御系統(tǒng)與活性氧始終處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦這個(gè)平衡被破壞，具有高反應(yīng)活性的氧自由基基團(tuán)就能直接造成機(jī)體生物膜系統(tǒng)的損傷，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞裂解死亡[1]。過剩的氧自由基會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，氧化機(jī)體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等生物大分子[2]，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)展或發(fā)生。因此，尋找活性高、副作用低且能改善機(jī)體生物大分子氧化損傷的天然抗氧化物質(zhì)對(duì)維持機(jī)體健康具有重要意義。

桑葉是我國衛(wèi)生部公認(rèn)的“藥食同源”植物資源，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)領(lǐng)域[3-4]。而桑葉生物堿是其重要活性成分之一，具有降糖、降脂、抗病毒、抗腫瘤等功效[5-6]。目前國內(nèi)外有關(guān)桑葉生物堿對(duì)生物大分子氧化應(yīng)激作用影響的研究主要在改善脂質(zhì)氧化方面[7]，對(duì)DNA、蛋白質(zhì)的氧化影響無相關(guān)報(bào)道。

生物活性成分的抗氧化活性在經(jīng)過胃腸消化后可能會(huì)發(fā)生變化[8]。而生物活性物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的消化吸收、代謝過程都非常復(fù)雜，采用體外消化模擬方法能迅速、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)生物活性物質(zhì)的功能在機(jī)體中的變化，有研究技術(shù)簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)[9]。但目前尚無桑葉生物堿在模擬胃、腸消化體系中抗氧化應(yīng)激能力的研究報(bào)道。本研究采用體外模擬胃、腸消化模型，評(píng)價(jià)桑葉生物堿在不同的消化階段抗氧化應(yīng)激能力的變化，以期為桑葉生物堿在生物體內(nèi)抗氧化活性變化與機(jī)理研究提供參考，為桑葉在醫(yī)藥及保健食品的應(yīng)用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉粉末，品種為勝利大葉，重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院提供。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)，購自美國Sigma公司；Gene Green核酸染料，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；FeCl3、FeSO4、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine, DNPH)、鹽酸胍、乙酸乙酯，均購自Mackin Biochemical公司；豬胰酶、熒光素鈉、β-胡蘿卜素、亞油酸，購自Aladdin Industrial Corporation；胃蛋白酶、膽汁鹽、2,4,6-三吡啶基三嗪(tripyridyltriazine, TPTZ)、水溶性VE(Trolox)、2,2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(2,2’-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride, AAPH)、牛血清蛋白、哌嗪-N,N’-雙(2-乙磺酸)(piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid，PIPES)、PUC-19質(zhì)粒DNA、瓊脂糖、10×Loading buffer、50×TAE電泳緩沖液，均購自Solarbio life sciences；三氯乙酸、醋酸鈉、無水乙醇、HCl、冰乙酸、H2O2、NaH2PO4、Na2HPO4、三氯甲烷、吐溫-80、乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraaceticacid, EDTA)，抗壞血酸，均購自成都科龍?jiān)噭Ｒ陨显噭┚鶠榉治黾儭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Symergy H1酶標(biāo)儀，基因有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-88恒溫?fù)u床，常州朗越儀器制造有限公司；811DK高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf AG；DYY-6D DNA凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GenoSens 1860凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；XW-80A 微型旋渦混合儀，上海瀘西儀器廠儀器有限公司；KQ5200DB超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 主要方法

1.3.1 桑葉生物堿制備

稱取桑葉粉，按料液比1∶30(g∶mL)，60 ℃，功率800 W，超聲處理60 min，重復(fù)提取2次，合并濾液，減壓濃縮；將濃縮液以2.1 BV/h流速過D101大孔樹脂；再將過D101的純化液以2.5 BV/h流速過732型陽離子樹脂吸附，先用蒸餾水洗至中性，再用0.5 mol/L氨水洗滌，然后以2倍柱體積洗脫的氨水洗脫液清洗；再將氨水洗脫液以2.1 BV/h流速過AB-8大孔樹脂，干燥得樣品[10-11]。本實(shí)驗(yàn)所制得的桑葉生物堿中總生物堿含量為93.57%。

1.3.2 體外模擬胃、腸消化

1.3.2.1 體外模擬胃消化

據(jù)MILLER等[12]體外模擬消化法對(duì)桑葉生物堿進(jìn)行模擬消化。取8.0 g桑葉生物堿，加入80 g生理鹽水，沸水浴15 min。冷卻后，采用去離子水將樣品的懸濁液恒質(zhì)量至88 g制得勻漿，用1 mol/L HCl溶液將pH調(diào)至2.0。

胃空白對(duì)照組(S0組)：取20 g調(diào)節(jié)pH后的均漿液，加入0.25 mL的去離子水。

鹽酸對(duì)照組(S1組)：取20 g調(diào)節(jié)pH后的均漿液，加入0.25 mL 0.01 mol/L HCl溶液。

胃消化組(S2組)：取20 g調(diào)節(jié)pH后的均漿液，加入0.25 mL的模擬胃液(0.2 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L HCl溶液)。

3個(gè)實(shí)驗(yàn)組均避光并充入氮?dú)?，?7 ℃恒溫水浴搖床中消化3 h。分別在反應(yīng)0、0.5、1、2、3 h時(shí)取出一定質(zhì)量的液體，4 ℃離心(12 000 r/min，15 min)，取上清液于-20 ℃凍存，備用。

1.3.2.2 體外模擬腸消化

按照模擬胃液方法制備胃消化2 h的勻漿樣品，然后用1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

腸空白對(duì)照組(G0組)：取20 g調(diào)節(jié)pH后的勻漿樣品，加入0.5 mL 0.1 mol/L NaHCO3緩沖溶液；

腸消化組(G1組)：取20 g調(diào)節(jié)pH后的勻漿樣品，加入0.5 mL模擬腸液(4 g胰酶、25 g膽汁鹽溶于1 L 0.1 mol/L NaHCO3溶液)。

2個(gè)實(shí)驗(yàn)組避光并充入氮?dú)?，?7 ℃恒溫水浴搖床里消化5 h。分別在胃消化0 h、腸消化0、0.5、1、2、3、4、5 h時(shí)取出一定質(zhì)量的懸濁液，4 ℃離心(12 000 r/min， 15 min)，取上清液于-20 ℃凍存，備用。

1.3.3 抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

1.3.3.2 鐵還原能力分析(FRAP值測(cè)定)

參照LU等[14]方法進(jìn)行鐵還原能力分析。結(jié)果用每g樣品中μmol FeSO4當(dāng)量表示，簡(jiǎn)寫為“μmol/g”。

1.3.3.3 β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析

根據(jù)SHONM等[15]方法略加修改。在96孔酶標(biāo)板加入50 μL待測(cè)液、200 μL的β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液，搖床80 r/min混勻1 min，50 ℃孵育反應(yīng)。于470 nm波長處測(cè)定初始反應(yīng)的吸光度以及反應(yīng)120 min后的吸光度，分別記為Α0和Α120，ΔA=Α0-Α120，ΔA越大表明β大胡蘿卜素氧化程度越高、褪色越多，計(jì)算見公式(1)。

(1)

式中：ΔA0表示不加樣品抑制時(shí)的褪色情況；ΔAi表示樣品加入后產(chǎn)生抑制作用時(shí)的褪色情況。

1.3.3.4 ORAC值測(cè)定

參照HUANG等[16]方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表示為μmol Trolox當(dāng)量每10 g樣品(μmol Trolox/10 g md)。

1.3.3.5 蛋白羰基測(cè)定

蛋白羰基含量的測(cè)定參照保健評(píng)價(jià)技術(shù)評(píng)價(jià)與規(guī)范修改稿測(cè)定[18]。

1.3.3.6 DNA保護(hù)潛力測(cè)定

根據(jù)ZHANG等[19]進(jìn)行DNA保護(hù)潛力的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0軟件、Image Lab軟件分析；圖表采用Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化中抗氧化活性

2.1.1 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化中DPPH自由基的清除能力

桑葉生物堿模擬胃腸消化對(duì)DPPH清除能力結(jié)果如圖1所示。

a-胃消化；b-腸消化圖1 桑葉生物堿模擬胃腸消化的DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging effect capacity of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion注：*表示顯著性差異(P<0.05)，**表示極顯著差異(P<0.01)。下同。

由圖1-a可知，在胃消化中，S0、S1組對(duì)DPPH清除能力呈現(xiàn)緩慢增長，而S2在0～1 h增長緩慢增；1～2 h內(nèi)，清除能力增長較為顯著，從268.90 mmol Trolox /100 g md增長到 504.67 mmol Trolox /100 g md，增長率為88%，2～3 h增長又恢復(fù)平穩(wěn)。在胃消化階段，S0、S1組之間不存在顯著性差異，當(dāng)胃消化達(dá)2 h時(shí)，S2組與2個(gè)對(duì)照組存在極顯著差異(P<0.01)； S2組在3 h時(shí)對(duì)DPPH清除能力達(dá)最大值，較0 h時(shí)提高了2.9倍(P<0.01)。

由圖1-b可知，在腸消化中，G0組對(duì)DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)緩慢增長趨勢(shì)，而G1組在0～1 h平穩(wěn)增長，1～2 h顯著增長，從562.30 mmol Trolox /100 g md增長到 686.47 mmol Trolox /100 g md，增長率為22%，2～5 h增長恢復(fù)平穩(wěn)。在整個(gè)腸消化階段，G1組與G0組存在極顯著差異(P<0.01)；G1組在5 h時(shí)對(duì)DPPH自由基清除能力達(dá)最大值，是 0 h的1.46倍(P<0.01)。

2.1.2 桑葉生物堿模擬體外胃腸消化中鐵還原能力分析

桑葉生物堿模擬胃腸消化FRAP結(jié)果如圖2所示。

a-胃消化；b-腸消化圖2 桑葉生物堿在模擬胃腸消化中的鐵還原能力分析Fig.2 FRAP analysis of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion

由圖2-a可知，在胃消化過程中，S0、S1組FRAP值均呈現(xiàn)平穩(wěn)增長，S2組0～2 h FRAP值呈現(xiàn)快速增長，從687.33 μmol/g增長到869.56 μmol/g，增長率為27%，2～3 h增長相對(duì)平穩(wěn)。在胃消化階段，S0、S1組之間不存在顯著性差異，消化達(dá)1 h，S2組與2對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)，消化達(dá)2 h時(shí)，存在極顯著差異(P<0.01)；S2組在3 h時(shí)FRAP值達(dá)最大，是0 h的1.98倍(P<0.01)。

由圖2-b可知，在腸消化中，G0組FRAP值平穩(wěn)增長。G1組的FRAP值在0～1 h平穩(wěn)增長，1～2 h顯著增長，從1 410.667 μmol/g增長到1 601.778 μmol/g，增長率為14%；2～5 h恢復(fù)增長平穩(wěn)。在腸消化達(dá) 2 h 時(shí)，G1組與G0組存在極顯著差異(P<0.01)； G1組在5 h時(shí)的FRAP值達(dá)到最大，是0 h的1.32倍(P<0.01)。

2.1.3 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化中β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析

桑葉生物堿在模擬胃腸消化中β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析結(jié)果如圖3所示。

a-胃消化；b-腸消化圖3 桑葉生物堿胃腸消化β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析Fig.3 Antioxidant effect of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion on β-carotene-linoleic acid system

由圖3-a可知，在胃消化中，S0、S1組對(duì)β-胡蘿卜素的褪色抑制率呈現(xiàn)緩慢增長，其抑制率很低，表明桑葉生物堿在這2種環(huán)境下的抗氧化作用不強(qiáng)，而S2組0～0.5 h的抑制率緩慢增加；0.5～2 h，抑制率增加很快并達(dá)到峰值；2～3 h抑制率的平穩(wěn)增加；S2組在3 h時(shí)抑制率達(dá)最大，是0 h的3.78倍(P<0.01)；隨著胃消化時(shí)間的延長，S2組逐漸降低H2O2對(duì)β-胡蘿卜素的漂白作用，其抑制率為16.99%～64.23%。

由圖3-b可知，在腸消化階段，G0組對(duì)β-胡蘿卜素褪色抑制率呈現(xiàn)緩慢增長；而G1組0～1 h內(nèi)抑制率相對(duì)平穩(wěn)增長，1～4 h其抑制率從69.80%增長到93.93%，增長迅速，4～5 h其抑制率又平穩(wěn)增長，G1組在5 h時(shí)對(duì)β-胡蘿卜素褪色的抑制率達(dá)到最大值，為95.14%，是0 h的1.49倍(P<0.01)。在腸消化時(shí)間階段，桑葉生物堿對(duì)β-胡蘿卜素褪色的抑制率為63.85%～95.14%，逐漸減緩H2O2對(duì)β-胡蘿卜素的漂白作用。

2.1.4 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化對(duì)ORAC值的影響

671 Application of systematic simulation training program in flexible ureteroscopy training

桑葉生物堿在模擬胃腸消化中對(duì)ORAC值的影響結(jié)果如圖4所示。

a-胃消化，b-腸消化圖4 桑葉生物堿模擬胃腸液樣品溶液熒光隨時(shí)間衰減曲線Fig.4 The attenuation curve of fluorescence intensity of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion

由圖4-a、圖4-b可知，各實(shí)驗(yàn)組均能延緩熒光物質(zhì)被活性氧自由基淬滅的速度，且順序?yàn)镾2組>S0組>S1組，G1組>G0組；同一實(shí)驗(yàn)組中隨著消化時(shí)間的延長，熒光衰退越慢。對(duì)每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，通過Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ORAC值，結(jié)果如圖5所示。

a-胃消化；b-腸消化圖5 桑葉生物堿模擬胃腸消化ORAC值變化Fig.5 Changes ORAC of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion注：折線上不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。下同。

由圖5-a可知，在胃消化階段，各實(shí)驗(yàn)組的ORAC值均隨著消化時(shí)間延長而呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；S0、S1組之間存在顯著性差異(P<0.05)，S2組與兩對(duì)照組均存在顯著差異(P<0.05)，S2組的ORAC值在3 h時(shí)達(dá)最大，為0 h的1.61倍(P<0.05)，是S0、S1組消化3 h時(shí)的3.41、11.34倍(P<0.05)，表明桑葉生物堿在胃消化液中保持較好抗氧化活性，且隨著消化時(shí)間的延長其抗氧化活性是增加的。

由圖5-b可知，在腸消化階段，G1組的ORAC值均顯著高于G0組(P<0.05)；G1組的ORAC值在5 h時(shí)達(dá)到最大，為腸消化0 h的1.45倍(P<0.05)，是G0組5 h的2.04倍(P<0.05)，同時(shí)也是胃消化0 h的1.67倍(P<0.05)，表明經(jīng)胃腸消化后的桑葉生物堿的抗氧化活性顯著提高。

2.2 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化對(duì)蛋白羰基的影響

桑葉生物堿在模擬胃腸消化對(duì)蛋白質(zhì)羰基的影響結(jié)果如圖6所示。

由圖6-a可知，未氧化BSA羰基含量1.950 nmol/mg蛋白，氧化12 h后BSA羰基含量驟升到3.324 nmol/mg蛋白。在胃消化中，與氧化BSA對(duì)照組相比，S0、S1組與其不存在顯著差異；當(dāng)胃消化達(dá)1 h 時(shí)，S2組與氧化BSA、S0、S1組均存在顯著性差異(P<0.05)；隨著消化時(shí)間的延長，S2組對(duì)BSA羰基含量的上升有顯著抑制作用，抑制率為15.84%～65.84%。

a-胃消化；b-腸消化圖6 桑葉生物堿在模擬胃消化中對(duì)BSA羰基的影響Fig.6 Effect of mulberry leaf alkaloid during simulated stomach digestion on carbonyl content of BSA注：圖中線條表示S2、G1組蛋白羰基含量的減少趨勢(shì)線。

2.3 桑葉生物堿體外模擬胃腸消化中DNA保護(hù)潛力的測(cè)定

體外模擬胃腸消化桑葉生物堿進(jìn)行DNA保護(hù)潛力(抗氧化能力)的測(cè)定結(jié)果見圖7。

圖7 體外模擬胃腸消化桑葉生物堿對(duì)DNA損傷保護(hù)Fig.7 The protection of DNA damage of mulberry leaf alkaloid during simulated gastrointestinal digestion注：a-空白組(不經(jīng)處理的DNA); b-對(duì)照組(紫外10 min +體積分?jǐn)?shù)30% H2O2處理);3～7-S2組(紫外10 min +各時(shí)間點(diǎn)的胃消化樣+30% H2O2處理)； 8～12-S1組(紫外10 min+各時(shí)間點(diǎn)的鹽酸對(duì)照樣+30% H2O2處理)； 13～17-S0組(紫外10 min+各時(shí)間點(diǎn)的胃空白對(duì)照樣+30% H2O2處理); c～i-G1組(紫外10 min +各時(shí)間點(diǎn)的腸消化樣+30%H2O2處理); j～p-G0組(紫外10 min +各時(shí)間點(diǎn)的腸空白對(duì)照樣+30% H2O2)。

由圖7可知，PUC19質(zhì)粒DNA在無抗氧化劑的保護(hù)作用下，經(jīng)過紫外線、體積分?jǐn)?shù)30%H2O2處理后，質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)幾乎完全降解成未知的DNA碎片或其他不同分子質(zhì)量的分子(圖7，泳道2、b)；分別加入模擬的胃腸消化液后，DNA分子受到了不同程度的保護(hù)，其作用是G1組>S2組，S0、S1、G0組之間不存在明顯差異，但明顯低于G1、S2組。

為了進(jìn)一步分析桑葉生物堿對(duì)DNA的保護(hù)潛力，根據(jù)軟件Image Lab分析得出各泳道中分子質(zhì)量條帶所占百分比，結(jié)果見圖8。

a-胃消化；b-腸消化圖8 各實(shí)驗(yàn)組DNA條帶所占百分比Fig.8 The percentage of DNA bands of each experimental group注：圖中線條表示S2、G1組DNA條帶占百分比的增長趨勢(shì)線。

由圖8可知，空白組質(zhì)粒DNA百分比與對(duì)照組存在極顯著差異(P<0.01)，表明體積分?jǐn)?shù)30%H2O2聯(lián)合紫外線處對(duì)PUC質(zhì)粒DNA具有較大的損傷作用；在胃消化中，S0、S1組與對(duì)照組對(duì)質(zhì)粒DNA保護(hù)作用在整個(gè)胃消化時(shí)間范圍內(nèi)任意兩兩比較均不存在顯著性差異(P>0.05)；在0～0.5 h，S2組質(zhì)粒DNA百分比與3個(gè)對(duì)照組間不存在顯著性差異，消化達(dá)1 h時(shí)，與3個(gè)對(duì)照組存在顯著性差異(P<0.05)；隨著胃消化時(shí)間的延長，S2組對(duì)質(zhì)粒DNA的保護(hù)作用增加：其保護(hù)率為6.68%～75.67%。在腸消化的過程中，與對(duì)照組、G0組相比，G1組對(duì)質(zhì)粒DNA保護(hù)作用與其均存在顯著性差異(P<0.05)；隨著腸消化時(shí)間的延長，G1組有效保護(hù)質(zhì)粒DNA的損傷：其保護(hù)率為70.50%～98.29%。在整個(gè)模擬胃腸消化的過程中，G1組對(duì)質(zhì)粒DNA損傷的保護(hù)作用強(qiáng)于S2組，表明桑葉生物堿在腸消化清除自由基的作用強(qiáng)于在胃消化的過程。

3 討論與結(jié)論

體外模擬胃腸消化系統(tǒng)是一種基于人體胃腸道生理機(jī)能進(jìn)行模擬食物消化行為的生物系統(tǒng)，具有簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)[20]。而目前有關(guān)生物堿類化合物抗氧化活性研究只有在化學(xué)環(huán)境分析而獲得的數(shù)據(jù)，均未考慮其在胃腸道中消化過程可能發(fā)生的變化。本研究采用桑葉生物堿通過體外模擬胃腸消化法，分析桑葉生物堿的抗氧化活性的變化規(guī)律，更加貼近人體對(duì)其的消化吸收情況，可為桑葉生物堿在體內(nèi)的功能性質(zhì)研究提供參考。

DPPH自由基結(jié)構(gòu)中1個(gè)N原子上含有1個(gè)未成對(duì)的電子，若其含有抗氧化活性物質(zhì)就會(huì)與其配對(duì)，深紫色的DPPH自由基就會(huì)被還原成黃色的非自由基形式[21]。FRAP分析不是反應(yīng)對(duì)某種自由基的清除能力，而是抗氧化物質(zhì)的總還原能力。本研究結(jié)果表明，桑葉生物堿在模擬胃腸消化的過程中對(duì)DPPH自由基的清除能力、FRAP值的變化趨勢(shì)相同，在胃、腸消化1 h后，DPPH自由基的清除能力、FRAP值顯著增加，腸消化2 h后均呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)，其中在腸消化的抗氧化能力強(qiáng)于胃消化。劉平懷等[22]的研究結(jié)果表明，樣品中生物堿與DPPH清除率之間存在劑量效應(yīng)關(guān)系，在1.6 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)91.59%。單虹宇等[23]研究顯示瑪咖生物堿具有較好還原三價(jià)鐵離子能力。與其他生物堿化合物相同，桑葉生物堿經(jīng)過胃腸消化后對(duì)DPPH自由基清除能力、還原三價(jià)鐵離子能力均有較強(qiáng)作用。β-胡蘿卜素-亞油酸體系中的亞油酸被氧化會(huì)產(chǎn)生漂白β-胡蘿卜素的H2O2自由基，則向體系中加入抗氧化物質(zhì)就會(huì)對(duì)自由基產(chǎn)生作用進(jìn)而減輕β-胡蘿卜素漂白情況[24]。本研究結(jié)果表明胃腸消化0.5、1 h后，桑葉生物堿抑制β-胡蘿卜素褪色率均顯著增加，分別到消化3、5 h后，達(dá)到2個(gè)消化階段的最大值，分別為該階段的3.78、1.58 倍，且隨消化時(shí)間的增加，抑制率加強(qiáng)，表明桑葉生物堿經(jīng)過胃腸消化后在油脂體系中仍具有較強(qiáng)清除自由基的作用。

ORAC方法具有穩(wěn)定的自由基引發(fā)劑，所產(chǎn)生的自由基與食品、生命現(xiàn)象中的自由基具有高度一致性，且其反應(yīng)機(jī)制是經(jīng)典的氫轉(zhuǎn)移反應(yīng)，是目前體外評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的主要方法之一[24]。已有研究表明，一些植物(翹果決明、米蘭花等)中的生物堿可以通過與O2發(fā)生碰撞使自身獲得能量，進(jìn)而使1O2失去活性使其轉(zhuǎn)變?yōu)?O2，是活性氧(ROS)的淬滅劑[25]。本研究結(jié)果表明，在模擬胃腸消化的過程中，隨著消化時(shí)間的延長，ORAC逐漸增加，胃腸消化階段的ORAC分別在366.952～591.528、423.877～613.230 μmol Trolox /10 gmd，且腸消化階段的ORAC值大于胃消化階段。推測(cè)其主要原因是其在胃、腸消化階段其結(jié)構(gòu)或者電性因素不同，當(dāng)雜環(huán)中的N原子裸露在外時(shí)有利于與ROS相接觸并與之反應(yīng)，供電基團(tuán)或者可以使N原子富有電子結(jié)構(gòu)的因素也會(huì)增加其抗氧化作用[26]。

綜上，桑葉生物堿經(jīng)過胃腸消化后具有較強(qiáng)的體外抗氧化作用，且能有效保護(hù)DNA、蛋白損傷，其機(jī)制有可能是桑葉生物堿的自身立體結(jié)構(gòu)或電性，具體的分子機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。本研究的結(jié)果表明，桑葉生物堿可能具有較強(qiáng)的抗氧化作用，有望應(yīng)用于保健食品領(lǐng)域。