譚勇，肖和淼，胡愛國，唐忠湘，黃文飛，唐旺

(1.邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽，422000； 2.湖南科瑞生物制藥股份有限公司，湖南 邵陽，422900)

甘草具有清熱解毒、止咳祛痰和調(diào)和諸藥的功效。而甘草酸是甘草中最主要活性成分，分子式為C42H62O16，相對分子質(zhì)量為822.92。甘草酸具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等作用。它還是一種天然甜味劑，屬于一種天然綠色食品添加劑。

根據(jù)現(xiàn)實生活中對甘草酸純度的不同要求，甘草酸產(chǎn)品分為甘草浸膏、粗制甘草酸和精制提純甘草酸。其中甘草浸膏的制法是：將甘草切片后用一定量水煎煮3次，每次煎煮時間為2h，最后再將3次的煎煮液合并放置過夜，經(jīng)沉淀后過濾，上清液濃縮至膏狀即可得甘草浸膏。粗提甘草酸方法有水提法[1]、稀氨水提取法[2]、乙醇提取法[3]、氨性乙醇提取法、超聲強化提取法[4]、微波輔助提取法[5]、超臨界流，體萃取法。甘草酸的水溶性鹽有低熱能、高甜度、起泡性、安全無毒和溶血作用低[6]的特點，且能與多種生物堿、氨基酸、抗生素等生成復(fù)方制劑或復(fù)鹽，具有協(xié)同、增溶、增加藥物穩(wěn)定性、提高生物利用率及降低毒副作用的功效。杜文彬等[7]通過水提法提取甘草酸得率為3.04%，通過稀氨水法提取甘草酸得率為9.26%，氨性醇提取法提取甘草酸得率為10.35%。游新勇等[8]以乙醇水溶液為提取劑，通過正交試驗優(yōu)化提取工藝，在最佳工藝條件下提取甘草酸的得率為27.2%。張嬙等[9]以含氨量為0.6%的65%乙醇溶液為提取劑，在最佳工藝條件下提取甘草酸的得率為12.59%。萬嘉洋等[10]通過乙醇提取法提取甘草酸得率為12.61%。

本實驗采用高效液相色譜法建立甘草酸的含量測定方法，以NaHCO3-乙醇水溶液為提取劑，利用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化甘草酸的提取工藝，為甘草中甘草酸的大規(guī)模工業(yè)研究提供一定的參考。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草藥材(市售)、無水乙醇(分析純)、冰乙酸(分析純)、醋酸銨(分析純)、甲醇、碳酸氫鈉(分析純)、濃硫酸(分析純)、蒸餾水、甘草酸單銨鹽對照品(99%)。

超聲清洗器(KQ-500E型 )，智能不銹鋼恒溫水槽(SYC)，磁力攪拌電熱套(GLT-LA型)，磁力攪拌機(HZ85-2型)，精密酸度計(FE20)，電子分析天平(FA224)，循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-3AB型)，高效液相色譜儀(ULtiMate 3000)，紫外分光光度計(UV-1780)。

1.2 熱回流提取工藝流程

甘草→粉碎→過60目目篩→60℃干燥4小時 →稱重→熱回流提取→靜置過夜→抽濾→濾液蒸發(fā)濃縮至20mL左右→冷卻→酸沉(pH≈2.0)→靜置過夜→過濾 →濾渣烘干得到粗產(chǎn)品→稱重

1.3 單因素實驗

根據(jù)預(yù)實驗得到的數(shù)據(jù)，從提取溫度、乙醇濃度、NaHCO3添加量以及提取時間4個方面分析各個因素對甘草酸提取率的影響。

基礎(chǔ)條件：甘草粉5g，提取溫度60℃，乙醇濃度60%，NaHCO3添加量0.3%，液料比15∶1，提取時間1.5h。

1)提取溫度對甘草酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5g甘草粉于圓底燒瓶中，加入濃度為60%的乙醇和0.3%(g/mL)的NaHCO3混合水溶液，按液料比15∶1混合均勻，熱回流時間為1.5h；提取溫度依次為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。根據(jù)工藝流程提取得到甘草酸粗產(chǎn)品，并對其進行高效液相色譜分析測定粗產(chǎn)品中甘草酸含量。

2)乙醇濃度對甘草酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5g甘草粉于圓底燒瓶中，加入0.3%(g/mL)的NaHCO3，按液料比15∶1混合均勻，提取溫度為60℃，熱回流時間為1.5h；乙醇濃度依次為0%、20%、40%、60%、80%。根據(jù)工藝流程提取得到甘草酸粗產(chǎn)品，并對其進行高效液相色譜分析測定粗產(chǎn)品中甘草酸含量。

3)NaHCO3添加量對甘草酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5g甘草粉于圓底燒瓶中，加入濃度為60%的乙醇，按液料比15∶1混合均勻，提取溫度為60℃，熱回流時間為1.5h；NaHCO3添加量依次為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%。根據(jù)工藝流程提取得到甘草酸粗產(chǎn)品，并對其進行高效液相色譜分析測定粗產(chǎn)品中甘草酸含量。

4)提取時間對甘草酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5g甘草粉于圓底燒瓶中，加入濃度為60%的乙醇和0.3%(g/mL)的NaHCO3混合水溶液，按液料比15∶1混合均勻，提取溫度為60℃；提取時間依次為1h、1.5h、2h、2.5h、3h。根據(jù)工藝流程提取得到甘草酸粗產(chǎn)品，并對其進行高效液相色譜分析測定粗產(chǎn)品中甘草酸含量。

1.4 甘草中甘草酸提取條件優(yōu)化正交試驗

此正交試驗以甘草酸提取率為實驗指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、乙醇濃度、NaHCO3添加量、提取時間的三個較優(yōu)水平進行4因素3水平的正交試驗。

1.5 高效液相色譜法測定

1.5.1 高效液相色譜分析色譜條件

色譜柱：C18柱 檢測器：紫外檢測器

流動相：(甲醇∶0.2mol/L醋酸銨∶冰醋酸)=65∶35∶1

柱溫：30℃ 流速：1mL/min

1.5.2 甘草酸單銨鹽對照品的制備

用電子分析天平精確稱取甘草酸單銨鹽3mg，用流動相溶解并定容于25mL容量瓶中，得到濃度為0.12mg/mL的甘草酸單銨鹽對照品溶液。

1.5.3 甘草酸單銨鹽最大吸收波長的確定

取一定量甘草酸單銨鹽對照品，用紫外分光光度計對其進行全波長掃描，結(jié)果在252nm處有最大吸收峰，因此高效液相色譜的檢測波長確定為252nm。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確吸取甘草酸對照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL分別置于10mL 的容量瓶中，搖勻，用流動相定容，在252nm處測峰面積。以甘草酸對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 甘草酸提取率計算公式

其中：M1為甘草酸粗產(chǎn)品中甘草酸的質(zhì)量；M2為甘草中甘草酸的總質(zhì)量。

1.7 甘草酸粗產(chǎn)品中甘草酸含量的測定

精確稱取甘草酸粗品0.02g，用流動相溶解定容于25mL容量瓶中，用0.45μm微孔濾膜過濾樣液，各樣液進樣20μL。按照上述1.5.1項下的色譜條件進行甘草酸含量的測定。

1.8 甘草中甘草酸總含量的測定

精確稱取3份甘草粉末各5g，在微波功率為250W，微波時間7min，液料比15∶1的條件下，微波提取5次，用高速離心機在5 000r/min條件下離心5min。取上清液用0.45μm的微孔濾膜過濾，各進樣10μL，按1.5.1項下的色譜條件進行甘草酸含量的測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以甘草酸單銨鹽對照品的質(zhì)量對峰面積進行回歸分析，得到線性回歸方程為：y=7326.3x+0.0728，R2=1，如圖1所示。

圖1 甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of monoammonium glycyrrhizinate

2.2 甘草中甘草酸總含量的測定

根據(jù)上述1.8項下實驗步驟，測得10μL上清液中甘草酸峰面積，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算出3份甘草中甘草酸總含量分別為為4.21%、4.02%、4.06%，平均含量為4.10%。

2.3 單因素實驗

2.3.1 提取溫度對甘草酸提取率的影響

由圖2可知，隨著提取溫度的不斷升高，甘草酸的提取率先增大后減小。當(dāng)溫度低于60℃時，甘草酸提取率隨溫度的升高而增大。當(dāng)溫度達到60℃時甘草酸提取率最大。當(dāng)溫度高于60℃以后，甘草酸提取率隨溫度的升高而減小。因此，本實驗選擇甘草酸的最佳提取溫度為60℃。

圖2 提取溫度對甘草酸提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.3.2 乙醇濃度對甘草酸提取率的影響

由圖3可知，在乙醇濃度小于60%時，甘草酸提取率隨著乙醇濃度的增加而增加；當(dāng)乙醇濃度大于60%時，甘草酸提取率隨著乙醇濃度增大而減小。因為甘草酸分子量較大且其分子結(jié)構(gòu)極不對稱，因此其極性很大，所以甘草酸易溶于極性大的提取劑，而水的極性雖然很大，但是有研究表明甘草酸在水中溶解度比較小[11]，當(dāng)乙醇濃度大于60%后，隨著其濃度的增加，提取液的極性不斷降低，從而導(dǎo)致甘草酸提取率下降。所以本實驗選擇60%乙醇作為提取劑。

圖3 乙醇濃度對甘草酸提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.3.3 NaHCO3添加量對甘草酸提取率的影響

由圖4可知，在NaHCO3添加量小于0.3%時，甘草酸提取率隨著NaHCO3添加量的增加而逐漸增大。當(dāng)NaHCO3添加量大于0.3%時，隨著NaHCO3添加量的增加甘草酸提取率反而降低。所以本實驗選擇的最佳NaHCO3添加量為0.3%。

圖4 NaHCO3添加量對甘草酸提取率的影響Fig.4 Effect of NaHCO3 addition on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.3.4 提取時間對甘草酸提取率的影響

由圖5可知，提取時間小于2h時，隨著提取時間的增加，甘草酸提取率逐漸升高。當(dāng)提取時間超過2h以后，甘草酸提取率反而下降。因此當(dāng)提取時間為2h時，甘草中甘草酸的提取率最大。所以本實驗選擇的最佳提取時間為2h。

圖5 提取時間對甘草酸提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.4 甘草酸的提取工藝條件優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以甘草酸提取率為考察指標(biāo)，選擇提取溫度、乙醇濃度、提取時間、NaHCO3添加量4個因素進行L9(34)正交試驗設(shè)計如表1所示，試驗結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

表1 因素水平Table 1 Factor level

A/℃ B/% C/hNaHCO3D/%150401.50.2260602.00.3370802.50.4

表2 正交試驗結(jié)果

Table 2 Orthogonal test results

ABCD/%11(50)1(40)1(1.5)1(0.2)26.36212(60)2(2.0)2(0.3)27.45313(80)3(2.5)3(0.4)24.1442(60)12329.785223131.566231226.3673(70)13229.148321330.879332126.19K1j77.9585.2883.5984.11K2j87.7089.8883.4282.95K3j86.2076.6984.8484.79T=251.85R9.7513.191.421.84C=7 047.602 5K1j26 076.202 57 272.678 46 987.288 17 074.492 1K2j27 691.298 078.414 46 958.896 46 880.702 5K3j27 430.445 881.356 17 197.825 67 189.344

表3 方差分析表

Table 3 Analysis of variance

FFαA18.37529.187 537.58F0.05(2,4)=6.94??B29.880214.9461.10F0.01(2,4)=18.00??CΔ0.40120.200 5NaHCO3D0.57720.288 5eΔ0.97840.244 549.2338

注：**代表具有極顯著性。

由表2和表3中的數(shù)據(jù)可以看出，影響甘草酸提取率的因素從大到小依次是：B>A>D>C。A表示因素有極顯著影響，B因素有極顯著影響，C因素?zé)o顯著影響，D因素?zé)o顯著影響。因此正交試驗最佳提取條件為A2B2C3D1。

綜合單因素與正交實驗的結(jié)果，可知甘草中甘草酸最佳提取工藝條件：乙醇濃度為60%，提取溫度為60℃，NaHCO3添加量為0.4%，液料比為15∶1，提取時間為2.5h。

2.5 甘草酸的最佳提取工藝條件驗證試驗

用分析天平稱取5g已粉碎的過60目目篩的甘草粉末共3份，按照最佳工藝條件進行提取，得甘草酸樣品，用高效液相色譜法測定樣品中甘草酸含量。結(jié)果測得甘草酸提取率分別為32.89%、33.35%、33.58%，平均提取率為32.27%。此驗證試驗表明了在最佳提取工藝條件下，甘草酸的提取率較高，且該工藝條件提取甘草酸的穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

本實驗采用熱回流法對甘草中的甘草酸進行提取。通過實驗結(jié)果可知，熱回流法從甘草中提取甘草酸的最佳工藝條件：乙醇濃度為60%，提取溫度為60℃，NaHCO3添加量為0.4%，液料比為15∶1，提取時間為2.5h。在最佳工藝條件下提取的粗產(chǎn)品中甘草酸含量比較接近，平均提取率為33.27%，重復(fù)性良好。用NaHCO3-乙醇作為提取劑，廉價易得，且NaHCO3相較于稀氨水來說更加綠色環(huán)保，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。