王棋文 李盼 潘翠云 韓芬霞

（1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 省部共建細(xì)胞分化調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新鄉(xiāng) 453007；2. 河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003）

尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Hydrodynamics-based transgene，HDT），又稱尾靜脈大容量快速基因注射法（Hight capacity and quick injection，HQI），其原理是短時(shí)間內(nèi)大量溶液從尾靜脈運(yùn)輸?shù)絼?dòng)脈時(shí)，導(dǎo)致大量溶液在下腔靜脈聚積，產(chǎn)生很高的靜脈壓使肝門靜脈打開，大量血液流入肝門靜脈，致使肝竇孔徑增大，肝細(xì)胞產(chǎn)生穿孔，膜透性增加，外源大分子進(jìn)入肝細(xì)胞，以此達(dá)到基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的目的［1］。液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有操作簡單、靶向性強(qiáng)、安全性好、轉(zhuǎn)染率高、對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生理功能無影響等優(yōu)點(diǎn)。液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)已是一項(xiàng)成熟的技術(shù)，基于液壓轉(zhuǎn)基因的優(yōu)點(diǎn)，此項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用。例如，Hubner等［2］利用液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行遺傳體內(nèi)修飾的組成型和誘導(dǎo)型系統(tǒng)研究。Yamazaki等［3］基于液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)小鼠尾靜脈注射編碼中和mAbs（Monoclonal antibodies）的質(zhì)粒，其對(duì)致死性流感病毒感染具有治療作用。然而該技術(shù)只能達(dá)到基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，因此探索保持外源基因持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的方法有著重要的意義。

乙二醇（Ethylene glycol，EG）是最簡單的二醇，與甘氨酸分子構(gòu)型相似，能調(diào)節(jié)甘氨酸核糖開關(guān)的終止子穩(wěn)定性和適配子從屬性，影響基因的轉(zhuǎn)錄［4］；液態(tài)乙二醇還能維持納米粒子表面熒光強(qiáng)烈和穩(wěn)定的發(fā)射［5］；乙二醇的高聚物聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）是一種相轉(zhuǎn)移催化劑，可以用于純化質(zhì)粒，也用于細(xì)胞融合；聚乙二醇通過質(zhì)粒表面的聚乙二醇化和內(nèi)部疏水作用增強(qiáng)了質(zhì)粒 DNA 超螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［6］。乙二醇也是一種有毒化合物，攝入后引起嚙齒動(dòng)物肝重增加、肝脂肪變性、透明氣球樣變和肝中心小葉退行性變。但目前對(duì)于在液壓轉(zhuǎn)基因中乙二醇對(duì)肝臟的作用和外源基因表達(dá)的影響尚未有研究，因此本研究用乙二醇和外源質(zhì)粒pEGFP-C1 共同進(jìn)行尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因后，檢測(cè)肝臟損傷情況和綠色熒光蛋白表達(dá)率，探索液壓轉(zhuǎn)基因中乙二醇對(duì)小鼠肝臟外源基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性小鼠，體重約 23±2 g，由河南師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-C1（購自美國BD Biosciences Clontech公司，綠色熒光蛋白的啟動(dòng)子來自巨細(xì)胞病毒，Cytomegalovirus，CMV）；乙二醇（分子量 62.07，河南焦作市化工三廠）；冰凍切片機(jī)（德國，Leica，CM1850）；熒光顯微鏡（日本，Nikon，ECLIPSE 80i）。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒制備 將購買的表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-C1 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB 固體培養(yǎng)基平板（含 100 μg/mL氨芐青霉素），37℃ 溫箱中倒置培養(yǎng)過夜，挑選出含質(zhì)粒 pEGFP-C1 的陽性菌株。將含質(zhì)粒 pEGFP-C1 的陽性菌株接種到10 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。取少量上述菌液（約1-2 mL）接種到200 mL LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。低溫離心收集菌體，NaOH-SDS堿裂解法裂解菌體，用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，PEG-NaCl 沉淀法純化質(zhì)粒，純化的質(zhì)粒用生理鹽水溶解。核酸蛋白含量測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒濃度與純度，260 nm/280 nm吸光值比值在1.8-2.0之間，且瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無基因組DNA和RNA時(shí)合格備用。

1.2.2 小鼠肝臟液壓轉(zhuǎn)基因 乙醚麻醉小鼠后，酒精棉球擦拭小鼠尾部，將無菌注射器針頭在小鼠尾1/3處刺入靜脈，快速均勻的將pEGFP-C1質(zhì)粒溶液注入尾靜脈，注射完后，用脫脂棉按住針眼處止血，最后在針眼處涂抹紅霉素軟膏以防止感染。

1.2.3 小鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和綠色熒光蛋白基因表達(dá)情況檢測(cè) 小鼠尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因后24 h、48 h和72 h時(shí)頸椎脫臼處死小鼠，取出肝葉液氮速凍10-15 s后，冰凍切片機(jī)內(nèi)平衡30 min，制備7 μm冷凍切片。（1）將冷凍切片進(jìn)行蘇木素染色3-5 min，細(xì)水沖洗后酒精鹽酸分色，自來水返藍(lán)10-15 min，甘油封片，觀察小鼠肝臟損傷；（2）在波長488 nm的熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）表達(dá)量，并隨機(jī)選取3個(gè)不重疊的視野（10×）拍照，分別統(tǒng)計(jì)綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞和DAPI復(fù)染的細(xì)胞核數(shù)目，計(jì)算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比率，計(jì)算轉(zhuǎn)染率。

2 結(jié)果

2.1 液壓轉(zhuǎn)基因的條件

依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前所建立的小鼠液壓轉(zhuǎn)基因條件［7］：注射速度0.8 mL/s，質(zhì)粒溶液注射量為小鼠體重的10%，質(zhì)粒濃度30 μg /mL將質(zhì)粒溶液均速注射到小鼠尾靜脈中。

2.2 液壓轉(zhuǎn)基因后綠色熒光蛋白在小鼠肝內(nèi)表達(dá)變化

按照結(jié)果2.1液壓轉(zhuǎn)基因的條件進(jìn)行小鼠尾靜脈注射pEGFP-C1質(zhì)粒，分別在尾靜脈注射后6 h、24 h、48 h、72 h取小鼠肝右葉觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況，并計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞比率。結(jié)果（圖1）表明，轉(zhuǎn)基因后，小鼠肝臟發(fā)白膨脹，肝索紊亂，細(xì)胞間隙變大，并發(fā)現(xiàn)血管壁破裂現(xiàn)象，但隨著恢復(fù)時(shí)間增加，癥狀減弱基本恢復(fù)正常。在轉(zhuǎn)基因后6 h綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞占2.22%，24 h陽性細(xì)胞比率最高為14.00%，48 h為3.11%，72 h為1.33%。

圖1 小鼠尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因后綠色熒光蛋白基因在肝內(nèi)的表達(dá)變化

2.3 乙二醇與液壓轉(zhuǎn)基因共同作用時(shí)小鼠肝臟的變化

2.3.1 液壓轉(zhuǎn)基因后24 h小鼠肝內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)變化及肝臟損傷情況 分別配制含0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.25 mol/L和0.5 mol/L乙二醇的 pEGFP-C1（30 μg/mL）質(zhì)粒溶液，按照結(jié)果2.1液壓轉(zhuǎn)基因條件進(jìn)行小鼠尾靜脈注射，在尾靜脈注射后 24 h取小鼠肝臟右葉觀察轉(zhuǎn)染率和肝臟損傷情況，結(jié)果（圖2）表明，隨著乙二醇濃度增加，肝臟損傷程度較重，出現(xiàn)大小不一，數(shù)量不等的空泡結(jié)構(gòu)。統(tǒng)計(jì)綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞率表明（圖3），乙二醇濃度為 0.05 mol/L時(shí)占 7.43%，0.1 mol/L時(shí)占3.96%，0.25 mol/L占3.72%，0.5 mol/L占1.93%。

圖2 乙二醇作用下液壓轉(zhuǎn)基因后24 h時(shí)小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察

圖3 乙二醇-液壓轉(zhuǎn)基因24 h后綠色熒光蛋白基因在小鼠肝臟內(nèi)的表達(dá)變化

2.3.2 液壓轉(zhuǎn)基因后72 h小鼠肝內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)變化及肝臟損傷情況 液壓轉(zhuǎn)基因后72 h取小鼠肝臟右葉觀察轉(zhuǎn)染率和肝臟損傷情況，結(jié)果（圖4）表明，小鼠肝臟損傷程度減弱，逐漸恢復(fù)，空泡結(jié)構(gòu)減少，但細(xì)胞間隙仍比較大。統(tǒng)計(jì)綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞率（圖5）表明，乙二醇濃度為0.05 mol/L時(shí) 占3.78%，0.1 mol/L時(shí) 占 9.67%，0.25 mol/L占10.11%，0.5 mol/L占15.96%。

圖4 乙二醇作用下液壓轉(zhuǎn)基因后72 h小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察

3 討論

尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Hydrodynamics-based transgene，HDT）是一種有效地成體體內(nèi)轉(zhuǎn)基因方法，用于多種基因功能分析［8］、甘露聚糖結(jié)合凝集素介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、RNA 干擾研究［9］、基因治療［10］等研究。本實(shí)驗(yàn)室過去對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行液壓轉(zhuǎn)基因研究表明，將大鼠體重9%的質(zhì)粒溶液（質(zhì)粒濃度為30 μg/mL），以2 mL/s的速度進(jìn)行大鼠尾靜脈注射，轉(zhuǎn)基因后約6 h綠色熒光蛋白達(dá)到較高表達(dá)率［11］。在此基礎(chǔ)上，我們以小鼠為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行液壓轉(zhuǎn)基因研究，將小鼠體重10%的質(zhì)粒溶液（質(zhì)粒濃度30 μg/mL），以0.8 mL/s的速度進(jìn)行小鼠尾靜脈注射，轉(zhuǎn)基因后約24 h綠色熒光蛋白達(dá)到較高表達(dá)率。

乙二醇是一種無色透明，揮發(fā)性低，無臭有甜味的黏稠液體，易溶于水等極性溶劑，是合成纖維、制造樹脂的主要原材料，并能用于多種化工生產(chǎn)。乙二醇具有一定的毒性［12］，屬低毒性化學(xué)物，但其代謝產(chǎn)物毒性較高。朱士勝等［13］研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠急性乙二醇中毒后肝臟細(xì)胞發(fā)生壞死。乙二醇的聚合物聚乙二醇能夠修飾一些藥物進(jìn)而改善藥性，例如鄭麗麗等［14］對(duì)聚乙二醇修飾甲硫氨酸腦啡肽靜脈注射時(shí)對(duì)熱板致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用研究發(fā)現(xiàn)聚乙二醇能夠修飾甲硫氨酸腦啡肽，然后靜脈注射到小鼠體內(nèi)時(shí)發(fā)現(xiàn)適當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量聚乙二醇修飾甲硫氨酸腦啡肽可提高鎮(zhèn)痛強(qiáng)度和藥效維持時(shí)間，對(duì)改善其成藥性具有積極意義。少量的攝入乙二醇后，能迅速分布于血液和組織液中，隨著血液循環(huán)輸送到不同組織器官，在肝臟乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）或其他肝酶催化下代謝生成羥乙醛、乙醇酸（Glycolic acid，GA）和乙醛酸［15］。隨后，乙醛酸轉(zhuǎn)化為草酸，草酸與鈣形成草酸鈣晶體，在腎臟和其他組織內(nèi)沉淀，會(huì)對(duì)動(dòng)物內(nèi)臟器官有一定的損傷［16］。這并不能否認(rèn)乙二醇具有一定的生物學(xué)作用。

本實(shí)驗(yàn)按照上述小鼠液壓轉(zhuǎn)基因條件進(jìn)行乙二醇與質(zhì)粒同時(shí)尾靜脈注射，發(fā)現(xiàn)乙二醇濃度在0.05 mol/L-0.5 mol/L 范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因后24 h時(shí)隨著乙二醇濃度升高，綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞率呈降低趨勢(shì)；72 h時(shí)陽性細(xì)胞率隨著乙二醇濃度升高而升高，且在72 h乙二醇濃度為 0.5 mol/L 時(shí)陽性細(xì)胞率較高。這一現(xiàn)象可能有兩個(gè)原因，一是隨著乙二醇濃度升高，小鼠肝臟損傷程度增大，24 h時(shí)肝臟損傷尚未恢復(fù)，致使綠色熒光蛋白基因在肝細(xì)胞中的表達(dá)量越低；而且隨著恢復(fù)時(shí)間推移，肝臟逐漸恢復(fù)正常，進(jìn)入肝細(xì)胞的質(zhì)?；謴?fù)正常表達(dá)；乙二醇濃度為 0.5 mol/L 時(shí)轉(zhuǎn)基因后72 h陽性細(xì)胞率較高，可能是因?yàn)橐叶紳舛容^高，對(duì)肝細(xì)胞毒性較大，增大了肝細(xì)胞的膜透性，液壓轉(zhuǎn)基因時(shí)進(jìn)入肝細(xì)胞的質(zhì)粒較多。二是乙二醇可能提高質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在乙二醇存在時(shí)，pEGFP-C1質(zhì)粒不能解超螺旋轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此 24 h時(shí)綠色熒光蛋白表達(dá)量較低，隨著肝臟恢復(fù)，乙二醇被消耗，pEGFP-C1 質(zhì)粒恢復(fù)轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究利用液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)將含有乙二醇的pEGFP-C1質(zhì)粒注射小鼠尾靜脈中，檢測(cè)對(duì)肝臟外源基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，乙二醇在液壓轉(zhuǎn)基因中能調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，使外源基因表達(dá)高峰向后推移，但具體作用機(jī)制還不甚清楚。該研究為研究乙二醇對(duì)肝再生的影響及探索乙二醇的其他生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。