馬開創(chuàng)，黃宏飛，彭吟雪，何東平,2，胡傳榮,2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023；2.國家糧食局糧油資源綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心，武漢 430023)

椰子不僅可以用來提取油脂，還是油料蛋白的重要來源之一。椰子蛋白中含有人體所需的18種氨基酸，8種必需氨基酸種類齊全，營養(yǎng)價(jià)值高，具有降血脂、降低膽固醇、抑制高血脂癥等保健功能[1-3]。

在椰子加工中，椰子蛋白作為加工椰子油等的副產(chǎn)品，基本都用作飼料，造成了椰子蛋白資源的嚴(yán)重浪費(fèi)[4]。雖然在特定區(qū)域制備椰子類食品有許多方法，但多數(shù)僅限于村莊或家庭規(guī)模[5]。如果椰子蛋白可以商業(yè)化生產(chǎn)，那么可以同時(shí)獲得椰子蛋白和椰子油兩個(gè)產(chǎn)品，從而整個(gè)椰子生產(chǎn)和加工業(yè)將受益匪淺。

目前關(guān)于椰子化學(xué)成分信息，尤其是蛋白質(zhì)的信息不全，我國對椰子蛋白的研究報(bào)道很少。椰子蛋白中含有30%的清蛋白、61.9%的球蛋白、1.1%的醇溶蛋白和4.7%的谷蛋白[6]。本文對改良Osboren法提取椰子蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對椰子蛋白的氨基酸組成和相對分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，以期為椰子蛋白的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

脫脂椰子粉(實(shí)驗(yàn)室自制)；氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、無水乙醇、正己烷、硼酸溶液；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀；FD-8型冷凍干燥機(jī)；TD5A-WS離心機(jī)；PHS-3C型pH計(jì)；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器；垂直電泳儀；BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)；S-3000N掃描式電子顯微鏡、E-1055磁控濺射器，日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 椰子蛋白分級提取工藝

(1)清蛋白：取200 g脫脂椰子粉，過100目篩，置于燒杯中，加入一定量的蒸餾水，在恒溫加熱磁力攪拌器中一定溫度下攪拌一段時(shí)間，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。沉淀加入蒸餾，再次攪拌浸提，離心。合并兩次所得的上清液，用0.1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH至4.5，在恒溫加熱磁力攪拌器中以45℃攪拌2 h，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。所得沉淀水洗至中性，冷凍干燥即為清蛋白。在-4℃條件下儲(chǔ)存。單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定提取條件為提取溫度50℃、提取時(shí)間4 h、液料比10∶1。

(2)球蛋白：將提完清蛋白后的殘?jiān)靡欢?.5 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行浸提，在恒溫加熱磁力攪拌器中一定溫度下攪拌一段時(shí)間，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。沉淀加入0.5 mol/L NaCl溶液，再次攪拌浸提，離心。合并兩次所得的上清液后用半透膜在去離子水中過膜72 h，5 000 r/min、4℃離心30 min得到沉淀，冷凍干燥后得到球蛋白。在-4℃條件下儲(chǔ)存。單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定提取條件為提取溫度50℃、提取時(shí)間4 h、液料比10∶1。

(3)醇溶蛋白：將提完球蛋白后的殘?jiān)靡欢恳掖既芤哼M(jìn)行浸提，在恒溫加熱磁力攪拌器中一定溫度下攪拌一段時(shí)間(用保鮮膜密封)，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。沉淀加入乙醇溶液，再次攪拌浸提，離心。合并兩次所得的上清液后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥后得到醇溶蛋白。在-4℃條件下儲(chǔ)存。單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定提取條件為提取溫度50℃、提取時(shí)間4 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比10∶1。

(4)谷蛋白:將提完醇溶蛋白后的殘?jiān)尤胍欢咳ルx子水，滴加0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，在恒溫加熱磁力攪拌器中一定溫度下攪拌一段時(shí)間，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。沉淀用NaOH溶液再次攪拌浸提，離心。合并兩次所得的上清液，滴加0.1 mol/L的HCl溶液至溶液pH降至4.5，然后在5 000 r/min、4℃條件下離心30 min。所得沉淀水洗至中性，冷凍干燥即為谷蛋白。在-4℃條件下儲(chǔ)存。單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定提取條件為提取溫度50℃、提取時(shí)間4 h、堿溶pH 10、液料比10∶1。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定

參照GB 5009.5—2016 測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 椰子蛋白凝膠電泳分析

稱取椰子蛋白樣品0.01 g溶于5 mL上樣緩沖液中，放入10 mL EP管中，渦旋振蕩1 min后，在10 000 r/min下離心10 min，移液槍準(zhǔn)確移取40 μL上清液與10 μL蛋白緩沖液充分混勻，在100℃加熱3 min使蛋白質(zhì)變性，準(zhǔn)備上樣。樣品蛋白采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒方法進(jìn)行檢測。使用BIO-RAD GelDoc 2000凝膠成像儀對膠進(jìn)行觀察和分析。

1.2.4 椰子蛋白氨基酸組成分析

取一定量的椰子蛋白樣品于60 mL水解管中，加入20 mL 6 mol/L的HCl溶液，充氮封管，在105℃下水解24 h，取出、冷卻、開管，用去離子水無損轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，并定容。準(zhǔn)確量取1 mL水解液于旋蒸瓶中，蒸干，加1 mL水再次蒸干，用0.02 moL/L的HCl復(fù)溶并定容至10 mL容量瓶中，待衍生，然后利用L-8900氨基酸分析儀測定椰子蛋白的氨基酸組成。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)采用Excel 2010統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析、作圖，顯著水平取P<0.05(差異顯著)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平均值(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 清蛋白提取條件的確定

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)(見圖1～圖3)

圖1 液料比對清蛋白提取率的影響

圖2 提取溫度對清蛋白提取率的影響

圖3 提取時(shí)間對清蛋白提取率的影響

由圖1～圖3可見：清蛋白提取率隨著液料比的增加先逐漸增大后趨于平緩，最佳液料比為10∶1； 清蛋白提取率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在50℃時(shí)達(dá)到最大值，這可能因?yàn)榍宓鞍壮^50℃后發(fā)生了變性而凝聚[7]；清蛋白提取率隨著提取時(shí)間的延長先增大后趨于平緩。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以液料比、提取溫度、提取時(shí)間為因素，以提取率為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化清蛋白提取工藝條件。清蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

由表1可知，影響椰子清蛋白提取率的因素大小順序?yàn)橐毫媳?提取時(shí)間>提取溫度，液料比的影響最大，提取溫度影響最小。最佳提取工藝條件為A2B2C2,即液料比10∶1、提取時(shí)間4 h、提取溫度50℃，在此條件下清蛋白提取率為49.05%。

表1 清蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2 球蛋白提取條件的確定

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)(見圖4～圖6)

圖4 液料比對球蛋白提取率的影響

圖5 提取溫度對球蛋白提取率的影響

圖6 提取時(shí)間對球蛋白提取率的影響

由圖4～圖6可見：球蛋白提取率隨著液料比的增大呈先增大后逐漸平緩的趨勢，在10∶1之前增加顯著；球蛋白提取率隨著提取溫度的升高先增大后減小，在50℃時(shí)達(dá)到最大；球蛋白提取率隨提取時(shí)間的延長先增加后減小，在4 h時(shí)達(dá)到最大。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以液料比、提取溫度、提取時(shí)間為因素，以提取率為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化球蛋白提取工藝條件。球蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 球蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可知，影響椰子球蛋白提取率的因素大小順序?yàn)橐毫媳?提取溫度>提取時(shí)間，液料比的影響最大。最佳提取工藝條件為A2B2C2，即液料比10∶1、提取時(shí)間4 h、提取溫度50℃，在此條件下球蛋白提取率為46.65%。

2.3 醇溶蛋白提取條件的確定

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)(見圖7～圖10)

圖7 液料比對醇溶蛋白提取率的影響

圖8 提取溫度對醇溶蛋白提取率的影響

圖9 提取時(shí)間對醇溶蛋白提取率的影響

圖10 乙醇體積分?jǐn)?shù)對醇溶蛋白提取率的影響

由圖7～圖10可見：隨著液料比的增加，醇溶蛋白提取率先增大，但增長趨緩，后稍微下降； 隨著提取溫度的升高，提取時(shí)間的延長，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，醇溶蛋白提取率均先增大后減少。醇溶蛋白主要由非極性氨基酸構(gòu)成，乙醇中的羥基極性較強(qiáng)，可以增大溶解度，提取率上升[8]，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，提取率降低。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以液料比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)為因素，以提取率為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化醇溶蛋白提取工藝條件。醇溶蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3 醇溶蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知，影響椰子醇溶蛋白提取率的因素大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>液料比>提取溫度。醇溶蛋白最佳提取工藝條件為A2B3C3D2，即液料比10∶1、提取時(shí)間5 h、提取溫度55℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，在此條件下醇溶蛋白提取率為18.01%。

2.4 谷蛋白提取條件的確定

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)(見圖11～圖14)

圖11 液料比對谷蛋白提取率的影響

圖12 提取溫度對谷蛋白提取率的影響

圖13 提取時(shí)間對谷蛋白提取率的影響

圖14 堿溶pH對谷蛋白提取率的影響

由圖11～圖14可見：液料比在10∶1之前谷蛋白提取率隨液料比增加而顯著增加，隨后增長緩慢；隨著提取溫度的升高谷蛋白提取率先增大后減小，在50℃時(shí)達(dá)到最大值；隨提取時(shí)間的延長谷蛋白提取率先增加后降低，在5 h時(shí)達(dá)到最大值；谷蛋白提取率隨堿溶pH的增大先提高后降低，在pH 10時(shí)達(dá)到最大值。

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以堿溶pH、提取溫度、提取時(shí)間、液料比為因素，以提取率為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化谷蛋白提取工藝條件。谷蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

表4 谷蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4可知，影響椰子谷蛋白提取率的因素大小順序?yàn)閴A溶pH>提取溫度>提取時(shí)間>液料比，堿溶pH的影響最大。谷蛋白最佳提取工藝條件為A2B2C2D2，即堿溶pH 10、提取時(shí)間4 h、提取溫度50℃、液料比10∶1，在此條件下谷蛋白提取率為26.78%。

2.5 4種椰子蛋白的純度和占比

在優(yōu)化的提取條件下，100 g脫脂椰子粉提取得到的4種蛋白的純度及占比見表5。

表5 4種椰子蛋白的純度及占比

由表5可以看出，從椰子蛋白中分離得到的清蛋白和球蛋白的質(zhì)量明顯高于醇溶蛋白和谷蛋白的質(zhì)量，二者占98.71%，球蛋白最多，占68.28%，清蛋白和球蛋白的純度也較高。這是因?yàn)榍宓鞍缀颓虻鞍讓儆诳扇苄缘鞍祝谒望}溶液中溶解比較完全，分離較徹底。

2.6 4種椰子蛋白的相對分子質(zhì)量分布(見圖15)

從圖15可以看出：椰子清蛋白的SDS-PAGE譜圖主要有4條譜帶，其相對分子質(zhì)量從上至下為152.4、104.9、77.5、58.2 kDa；球蛋白主要有2條譜帶，其相對分子質(zhì)量從上至下為54.6、38.6 kDa；醇溶蛋白只有1條譜帶，其相對分子質(zhì)量為21.6 kDa；谷蛋白主要有4條譜帶，相對分子質(zhì)量從上至下為58.7、35.5、26.3、19.3 kDa。除了清蛋白有2條相對分子質(zhì)量較大的譜帶外，其余3種蛋白相對分子質(zhì)量都較小，小分子蛋白更有利于人體吸收。

注：a.Marker標(biāo)準(zhǔn)蛋白；b.清蛋白；c.球蛋白；d.醇溶蛋白；e.谷蛋白。

圖15 4種椰子蛋白的SDS-PAGE譜圖

2.7 椰子蛋白的氨基酸組成(見表6)

表6 3種椰子蛋白的氨基酸組成g/100 g

氨基酸清蛋白球蛋白谷蛋白異亮氨酸2.33.63.5亮氨酸3.26.16.1賴氨酸4.73.43.2蛋氨酸0.92.61.8苯丙氨酸2.26.34.3蘇氨酸2.93.72.9纈氨酸3.17.57.0組氨酸1.93.22.4酪氨酸4.13.12.9天冬氨酸6.59.39.1絲氨酸2.53.82.0谷氨酸19.816.913.7甘氨酸3.56.25.2丙氨酸3.43.93.3精氨酸17.314.712.8

由表6可知，3種椰子蛋白中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量明顯高于其他氨基酸，而蛋氨酸相對較缺乏。

3 結(jié) 論

(1)采用改良Osboren法對脫脂椰子粉進(jìn)行分級提取得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為：①在液料比10∶1、提取時(shí)間4 h、提取溫度50℃條件下，清蛋白提取率為49.05%，純度為57.1%；②在液料比10∶1、提取時(shí)間4 h、提取溫度50℃條件下，球蛋白提取率為46.65%，純度為70.8%；③在液料比10∶1、提取時(shí)間5 h、提取溫度55℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%條件下，醇溶蛋白提取率為18.01%，純度為32.7%；④在液料比10∶1、提取時(shí)間4 h、提取溫度50℃、堿溶pH 10條件下，谷蛋白提取率為26.78%，純度為70.4%。

(2)椰子清蛋白、球蛋白及谷蛋白的谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量明顯高于其他氨基酸，而蛋氨酸相對較缺乏。清蛋白電泳圖譜中有2條譜帶相對分子質(zhì)量較大，其余3種蛋白相對分子質(zhì)量都較小。整體來說椰子蛋白是較為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)。