李艷麗，熊 歡，彭小博，鄒 鋒，袁德義

(中南林業(yè)科技大學(xué), 經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室, 經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室, 經(jīng)濟林培育與利用湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南 長沙 410004)

【研究意義】錐栗(CastaneahenryiRehd.et Wils)屬殼斗科(Fagaceae)栗屬(Castanea)植物，是我國南方特有的木本糧食樹種，分布于秦嶺-淮河以南地區(qū)，其中在福建、浙江和湖南等山區(qū)資源分布最為集中[1]。我國現(xiàn)有錐栗的種植面積達100萬 hm2，年產(chǎn)值數(shù)十億元[2]。發(fā)展錐栗生產(chǎn)對于促進山區(qū)精準(zhǔn)扶貧、建設(shè)美麗鄉(xiāng)村具有重要的意義。近年來，錐栗在我國南方丘陵山區(qū)開始大規(guī)模的人工種植。實生苗適應(yīng)性廣、生長較快，由于遺傳變異較大，存在童期長、掛果遲的問題，直接限制了當(dāng)前錐栗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的進程。然而嫁接苗不僅可以保持親本優(yōu)良品種的性狀，提高錐栗苗木對環(huán)境的適應(yīng)能力，還可以縮短童期、提早開花結(jié)果[3]。苗木的光合能力影響其生長和發(fā)育，而葉片是植物進行光合作用的主要器官[4]，特別是葉片內(nèi)部各種組織的厚度和比例、葉肉細胞的大小和排列等結(jié)構(gòu)特征會很大程度地影響葉片的光合功能[5]?！厩叭搜芯窟M展】目前，在植物葉片結(jié)構(gòu)與光合特性的關(guān)系上已有一些研究報道。例如，黃娟等曾以楊樹(Populustremula)為試材，發(fā)現(xiàn)楊樹的葉肉組織厚度與其氣體交換能力存在相關(guān)關(guān)系[6]；梁文斌等曾以短梗大參(Macropanaxrosthornii)苗木為試材，發(fā)現(xiàn)葉綠素含量的增加有利于植物在低光強下更有效、更多地吸收光能[7]；祁傳磊等曾研究發(fā)現(xiàn)大青楊(PopulusussuriensisKom.)的葉片結(jié)構(gòu)(葉面積、柵欄組織厚度及柵欄組織與海綿組織厚度的比值)與其光合能力的關(guān)系密切[8]。在錐栗的研究上，主要集中在良種選育[9]、高效栽培技術(shù)[10]以及加工利用[8]等方面。然而關(guān)于錐栗嫁接苗與實生苗在葉片生長狀況、形態(tài)結(jié)構(gòu)及光合特性上的研究則報道較少?！颈狙芯壳腥朦c】因此，本文以2年生錐栗嫁接苗與實生苗為試材，對比分析葉片生長狀況、形態(tài)結(jié)構(gòu)及光合特性的差異，探明嫁接苗與實生苗葉片的結(jié)構(gòu)與光合利用的相關(guān)關(guān)系，為錐栗的良種苗木繁育提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗場所選在中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)樓，位于112°59′32″ E，28°8′14″ N，海拔約100 m。試驗以2年生盆栽錐栗嫁接苗與實生苗為材料，其中嫁接苗砧木為‘華栗4號’，接穗品種為‘華栗4號’；實生苗采用‘華栗4號’種子實生播種，基質(zhì)為黃心土∶泥炭∶珍珠巖=4∶2∶1。

1.2 測試項目及方法

1.2.1 葉片顯微結(jié)構(gòu)和生長參數(shù) 2017年8月上旬，于晴天上午采集成熟錐栗葉片，采用無色透明的指甲油印跡法，進行氣孔密度測定[11]；采用30 % NaOH溶液浸泡和0.5 %甲苯胺藍染色法[12]， 進行葉脈密度測定；采用石蠟切片法[13]，運用OLYMPUS-BX53型顯微鏡進行葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察；選取苗木第2～4節(jié)完全開展的葉片20個，進行葉片生長指標(biāo)測定，即面積、周長、葉長、葉寬、干重和比葉面積(即葉面積/葉片干重)等[14]。

1.2.2 葉綠素含量(Cc) 取新鮮葉片0.02 dm2放入試管中，加10 mL的丙酮乙醇(V∶V=1∶1)提取液，用UV-1100型分光光度計(上海，中國)進行光合色素：葉綠素a(Chlorophyll a，Chla)和葉綠素b(Chlorophyll b，Chlb)含量的測定[15-16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel2013和Origin8.5分別進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和繪制折線圖，運用SPSS19.0進行單因素方差、差異顯著性(P<0.05)及線性相關(guān)關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片生長參數(shù)

如表1所示，嫁接苗葉片的面積、周長、長度、寬度及干物質(zhì)量均較實生苗高，而比葉面積則低于實生苗。嫁接苗葉面積44.23 cm2是實生苗(24.55 cm2)的1.80倍；嫁接苗葉片干質(zhì)量0.29 g是實生苗(0.14 g)的2.07倍；然而實生苗比葉面積182.76 cm2·g-1是嫁接苗(152.10 cm2·g-1)的1.20倍。

表1 錐栗嫁接苗與實生苗葉片生長情況比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示P<0.05顯著差異，下同。

Note：Values are means±SE.Values within a column followed by the different normal letters are significantly different atP<0.05.The same as below.

2.2 葉片顯微結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 表皮細胞(EC) 比較錐栗苗木葉片的表皮細胞(表2和圖1 A～B)后可以看出，錐栗不同苗木的上下表皮厚度差異顯著(P<0.05)，嫁接苗的上/下表皮細胞厚度均較實生苗厚。嫁接苗上/下表皮細胞體積較大、排列疏松呈不規(guī)則形狀；而實生苗表皮細胞則排列緊密，形狀較為規(guī)則。

2.2.2 葉肉細胞(MC) 錐栗葉片屬于典型的異面葉，即柵欄組織細胞(Palisade cell)和海綿組織細胞(Spony mesophyll)分化明顯(圖1A～B)。一般而言，柵欄組織細胞呈柱狀水平排列，深2層；海綿組織形狀不規(guī)則，排列疏松。錐栗不同苗木的柵欄組織厚度和海綿組織厚度的差異顯著(P<0.05)(表2)。嫁接苗的柵欄組織和海綿組織形狀較實生苗不規(guī)則、排列較實生苗不夠緊密。嫁接苗的柵海比值1.39是實生苗(1.26)的1.10倍。

2.2.3 葉脈特征(VC) 錐栗葉片的維管束屬于外韌型，即主脈直徑較大，機械組織(Mechanical organization,Mo)較發(fā)達(圖1 C～D)。嫁接苗主脈厚度1168.43 μm是實生苗(848.43 μm)的1.38倍(表2)。嫁接苗與實生苗葉脈密度的差異顯著(P<0.05)，嫁接苗葉脈密度0.95 mm·mm-2>實生苗(0.72 mm·mm-2)(表2和圖1E～F)。

2.2.4 氣孔特征(SC) 錐栗葉片氣孔屬于典型的腎形氣孔，主要分布在葉片下表皮(圖1G～H)。錐栗不同苗木的氣孔密度差異顯著(P<0.05)，嫁接苗氣孔密度145.00 個·mm-2>實生苗73.00 個·mm-2。嫁接苗氣孔數(shù)目較多且分布密集；實生苗氣孔數(shù)目較少且分布稀疏。

2.3 葉片光合參數(shù)

2.3.1 光合-光響應(yīng)曲線(Pn-PPFD) 由圖2和表3可知，2種苗木葉片的Pn-PPFD曲線走勢基本一致，曲線的形狀可隨PPFD狀況的改變發(fā)生變化。在弱光(PPFD<200 μmol·m-2·s-1)條件下，Pn呈直線上升，但差異較??；隨著光強的進一步增大(高于光補償點)，Pn的上升幅度逐漸減小，嫁接苗的Pn較實生苗高，且差異顯著(P<0.05)。2種苗木的Pmax、LCP、Rd及AQY差異顯著(P<0.05)(表3)，嫁接苗的LSP為680.60 μmol·m-2·s-1<實生苗(705.20 μmol·m-2·s-1)、Pmax為6.77 μmol·m-2·s-1是實生苗(5.13 μmol·m-2·s-1)的1.32倍、AQY為0.05較實生苗(0.04)高出18 %。

表2 錐栗嫁接苗與實生苗葉片顯微結(jié)構(gòu)比較

A嫁接苗葉肉組織橫切面；B實生苗葉肉組織橫切面；C嫁接苗葉片主脈橫切面；D實生苗葉片主脈橫切面；E嫁接苗葉脈結(jié)構(gòu)；F實生苗葉脈結(jié)構(gòu)；G嫁接苗葉片下表皮氣孔；H實生苗葉片下表皮氣孔。 UE：上表皮； PT：柵欄組織；ST：海綿組織；LE：下表皮；LVB：側(cè)脈；MT：機械組織； Me：葉肉；X：木質(zhì)部；Ph：韌皮部；GT：基本組織；V：葉脈；SA:氣孔器；EC：表皮細胞；Sto：氣孔；GC：保衛(wèi)細胞；EP：表皮；EH：表皮毛。A～B, 標(biāo)尺=100 μm；C～F, 標(biāo)尺=200 μm；G～H, 標(biāo)尺=50 μmA mesophyll cross section of grafts; B mesophyll cross section of seeds; C main vein cross section of grafts; D main vein cross section of seeds; E vein structure of grafts; F vein structure of seeds; G epidermal stomata of grafts; H epidermal stomata of seeds. UE, upper epidermis. PT: palisade tissue; ST: spongy tissue; LE, lower epidermis; LVB, lateral veins; MT, mechanical tissue; Me, mesophyll; X, xylem; Ph, phloem; GT: basic tissue; V: veins; SA: stomatal apparatus; EC: epidermal cells; Sto: stomata; GC: guard cells; EP: epidermis; EH: epidermal hair. A-B, Bar = 100 μm; C-F, Bar = 200 μm; G-H, Bar = 50 μm圖1 錐栗嫁接苗與實生苗葉片結(jié)構(gòu)特征Fig.1 Leaf structure characteristics of grafts and seeds ofC.henryi

圖2 錐栗嫁接與實生苗的凈光合速率對不同光照強度的響應(yīng)Fig.2 Response of net photosynthetic rate ofC.henryigrafts and seeds under different light intensities

2.3.2 光合參數(shù) 如表4所示，Pn、Gs及Ci呈顯著性差異(P<0.05)。嫁接苗Tr、Pn、Gs及WUE較實生苗高，而嫁接苗Ci為299.49 μmol·mol-1則較實生苗(359.68 μmol·mol-1)低。2種苗木的葉綠素含量Cc呈顯著差異(P<0.05)，嫁接苗Cc：4.35 mg·dm-2>實生苗2.43 mg·dm-2。

2.4 葉片結(jié)構(gòu)與光合特性的相關(guān)關(guān)系

由表5可知，2種苗木葉片的葉綠素含量(Cc)、柵欄組織厚度(FTT)、海綿組織厚度(STT)、上表皮細胞厚度(UECT)、葉面積(LA)以及氣孔密度(SD)與凈光合速率(Pn)呈極顯著的正相關(guān)；葉片干物質(zhì)量(LDMQ)與凈光合速率(Pn)的正相關(guān)關(guān)系則不顯著。兩種苗木葉片的比葉面積(SLA)與Pn的負相關(guān)關(guān)系則未達到顯著水平。2種苗木葉片的SD與氣孔導(dǎo)度(Gs)呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

光合-光響應(yīng)曲線(Pn-PPFD)揭示了葉片的光合特性[19]。光補償點LCP和光飽和點LSP分別表示植物利用弱光和強光的能力[1]。與實生苗相比，嫁接苗的LCP低和LSP高，說明了嫁接苗對弱光和強光環(huán)境的適應(yīng)能力強于實生苗。Pmax表示了植物的潛在最大凈光合效率，即光飽和點(LSP)時的光合速率[20-21]。本研究測得的嫁接苗Pmax值高于實生苗，且差異顯著(P<0.05)，表明了在相同的生長環(huán)境下，嫁接苗的光合能力較強。一般情況下，植物的光合能力與暗呼吸速率Rd呈正相關(guān)性，即LSP越高、Rd越大[22]。本文中，錐栗嫁接苗的LSP和Rd值都高于實生苗，這也表明了嫁接苗具有較強的光合能力。

表3 錐栗嫁接苗與實生苗的凈光合速率對光合有效輻射響應(yīng)的特征參數(shù)

Table 3 The characteristic parameters of the net photosynthetic rate of grafts and seeds ofC.henryion the photosynthetic active radiation response

最大凈光合速率(μmol·m-2·s-1)Maximum netphotosynthetic rate光補償點(μmol·m-2·s-1)Light compensationpoint光飽和點(μmol·m-2·s-1)Light saturationpoint表觀量子效率Apparent quantum yield暗呼吸速率(μmol·m-2·s-1)Dark respiration嫁接苗Grafts6.77±0.02a17.79±0.08a705.20±6.240.05±0.00a1.02±0.01a 實生苗Seeds5.13±0.00b25.20±0.01b 680.60±4.360.04±0.00b0.83±0.00b

表4 錐栗嫁接苗與實生苗葉片光合參數(shù)的差異

表5 錐栗嫁接苗與實生苗葉片結(jié)構(gòu)與光合特性的線性相關(guān)關(guān)系

植物葉片的光合速率是通過測定凈CO2吸收得到的，而光合細胞內(nèi)真正的CO2供應(yīng)效率是受葉片表皮氣孔細胞的控制[5]。比較錐栗不同苗木下表皮氣孔的差異后發(fā)現(xiàn)，嫁接苗氣孔的單位面積數(shù)目較多，同時期的開放程度較大，且分布密集。在光合指標(biāo)(Pn、Ci和Gs)的方面，嫁接苗的Pn和Gs值高于實生苗，Ci較實生苗低，其中氣孔導(dǎo)度Gs(即氣孔開放程度)的大小變動直接影響光合作用所需底物CO2的供應(yīng)，從而影響葉片的光合速率[5]。這表明嫁接苗較高的氣孔密度、Gs及較低的比葉面積(即CO2進入細胞壁的阻力小)有益于光合作用底物CO2順利地進入葉片，因而增強葉片的Pn。

葉片的解剖結(jié)構(gòu)高度特化，以便更好地吸收陽光[23]。葉片表皮層細胞對可見光是完全透明的，單個細胞常呈平凸?fàn)钇鸬骄酃庾饔?，聚集進入光合細胞的光線，因而使到達葉綠體的PPFD提高到周邊光量的數(shù)倍之多[24]。本文中，嫁接苗的表皮層細胞較實生苗具有凹面突出、體積大、形狀不規(guī)則及排列疏松的特征，更利于外界光線較多地聚集進入葉片內(nèi)部，且對適應(yīng)不同強度的光照也有較好的調(diào)節(jié)功能。植物的柵欄層細胞就像導(dǎo)光管，最外層葉綠素含量非常高，能夠增加直射光的透射深度[24]，而葉綠素是光合生物中的典型色素，具有吸收光以驅(qū)動光合作用的功能[25]。研究顯示，錐栗苗木的柵欄組織呈柱狀平行排列、深2層，其中嫁接苗的柵欄組織厚度顯著高于實生苗。在葉綠素含量Cc的測定上，錐栗不同苗木Cc的差異顯著(P<0.05)，且與Pn之間呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)。這表明，在嫁接苗柵欄組織中，葉綠體的分布數(shù)目可能多于實生苗，并在光合作用過程中吸收較多的光量，從而增強柵欄組織細胞的的光合效率。錐栗不同苗木的海綿組織細胞形狀不規(guī)則，并被空氣泡包圍著，由空氣泡所組成的氣體空間為散射光線提供了大量的氣-水界面。因此，光在細胞和氣體的界面上可進行多次反射，從而很大程度上延長了光的傳遞路徑，也因而增加了光能被吸收的可能性[26]。研究顯示，與實生苗相比，嫁接苗的海綿組織細胞排列較疏松、包圍在外的空氣泡較大，因而氣-水界面也較多。由此發(fā)現(xiàn)，嫁接苗的 柵欄組織結(jié)構(gòu)特性利于光順利進入葉片;海綿組織結(jié)構(gòu)特性益于光的散射和反射，由此較實生苗就能更均衡地吸收和利用光，從而更好地進行光合作用。一般來講，葉片主脈的厚度越大[27]、葉脈的密度越大，葉片內(nèi)部的水分運送效率也越高。本文中，錐栗不同苗木葉片的主脈厚度、葉脈密度與水分利用效率WUE的相關(guān)性顯著(P<0.05)，且嫁接苗的主脈厚度、葉脈密度和WUE都高于實生苗，這表明了嫁接苗葉片較高的水分利用水平、合成的有機物運轉(zhuǎn)能力與其葉片結(jié)構(gòu)特征關(guān)系密切。

4 結(jié) 論

本文研究表明，2年生錐栗苗木葉片整體(氣孔、光合機構(gòu)和葉脈疏導(dǎo)組織等)相互協(xié)調(diào)響應(yīng)對葉片的光合作用產(chǎn)生一定影響；嫁接苗與實生苗在葉片生長狀況、葉片解剖結(jié)構(gòu)及光合特性方面呈顯著差異(P<0.05)，嫁接苗對光的適應(yīng)性和光能利用能力強于實生苗。