郭玉華 徐云 張雪茹 金日生

摘要[目的]以油茶籽餅粕為原料，優(yōu)化油茶籽餅粕多糖提取工藝，并對(duì)純化后的多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。[方法]根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以超聲時(shí)間10、15、20min;料液比1∶15、1∶20、1∶25;浸提溫度50、60、70℃;浸提時(shí)間60、90、120min為影響因素，多糖得率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝。粗多糖經(jīng)脫色，脫蛋白處理后，再經(jīng)過DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂純化，并對(duì)純化多糖組分進(jìn)行紫外光譜和高效液相色譜分析。[結(jié)果]超聲時(shí)間10min，料液比1∶20，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間120min為最佳工藝條件，此條件下油茶籽餅粕多糖的平均得率16.76%。粗多糖經(jīng)脫色、脫蛋白、纖維素陰離子交換樹脂柱層析得到純化組分CCP。紫外光譜表明CCP為較純的均一多糖組分，高效液相色譜表明CCP的單糖組成為甘露糖和葡萄糖，其物質(zhì)的量比為：1.91∶1.00。同時(shí)還含有少量的鼠李糖。[結(jié)論]該工藝優(yōu)化合理，多糖的結(jié)構(gòu)得到了初步的確證。研究為油茶籽餅粕多糖的后續(xù)理化活性分析、結(jié)構(gòu)表征提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞油茶籽餅粕;多糖;工藝優(yōu)化;分離純化;結(jié)構(gòu)鑒定

中圖分類號(hào)TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0167-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.050

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

油茶與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本食用油料植物。它生長(zhǎng)在中國南方亞熱帶地區(qū)的高山及丘陵地帶，是中國特有的一種純天然高級(jí)油料。主要集中在浙江、江西、河南、湖南、廣西、安徽等地[1]。油茶籽粕為油茶籽榨取茶油后的餅粕，含有30%～50%的糖類物質(zhì)[2]。茶籽粕中還含有茶皂素、茶籽蛋白等，它們都是化工、輕工、食品、飼料工業(yè)產(chǎn)品等的原料[3]，具有很高的綜合利用價(jià)值。

目前，對(duì)于多糖的提取方法主要是水體醇沉法，再以超聲[4]、微波[5]、酶法[6]等輔助提取，以提高多糖的得率和提取效率。超聲波輔助提取法可快速高效地從植物中提取有效成分，已應(yīng)用于白及多糖[7]、紅腰豆多糖[8]等多種植物多糖的提取。多糖具有抗氧化[9]、增強(qiáng)免疫[10]、降血糖[11]等多種生物活性，其純度及結(jié)構(gòu)對(duì)多糖的活性有顯著的影響[12]。目前，對(duì)于油茶籽餅粕多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定鮮有報(bào)道。作為油茶產(chǎn)業(yè)鏈的下游產(chǎn)物，從廢物再利用的角度出發(fā)，從中提取多糖有利于加深油茶的開發(fā)利用，進(jìn)一步提高其應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該試驗(yàn)利用正交試驗(yàn)法對(duì)油茶籽餅粕多糖的超聲波提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行分離純化及其結(jié)構(gòu)表征，以為油茶籽餅粕資源的深度開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1.1材料與試劑

1.1.1試驗(yàn)材料。油茶籽餅粕：源自安徽省金寨縣大別山。單糖標(biāo)準(zhǔn)品，DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂：Sigma公司;考馬斯亮藍(lán)染料，濃硫酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉均為分析純，國藥試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.2試驗(yàn)儀器。亞榮RE-5286A電動(dòng)升降旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）;TG16-WS/TG16WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;FD-B10N-50冷凍干燥機(jī)（冠森生物科技有限公司）;752N紫外可見分光光度計(jì)（上海精科分析儀有限公司）;Nexus型傅里葉紅外變換光譜儀（美國Thermonecolet公司）;Aglient1100高效液相色譜儀（美國Aglient公司）。

1.2油茶籽餅粕總多糖的提取油茶籽餅粕→粉碎→過篩（40目）→按一定料液比加蒸餾水→超聲預(yù)處理→水浴浸提→離心取上清（4000r/min，10min）→濃縮至上清液體積的1/5→4倍上清液體積的無水乙醇沉淀→4℃冰箱沉淀過夜→離心（4000r/min，10min）→收集沉淀→冷凍干燥→得油茶籽餅粕多糖，收集備用。

1.3測(cè)定方法

以苯酚-硫酸比色法[13]繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，總糖質(zhì)量濃度（C）與吸光度（A）之間的回歸方程為Y=7.452C+0.002（R2=0.997）。將水體醇沉法得到的粗多糖溶于一定體積的蒸餾水中，并進(jìn)行稀釋，在495nm處測(cè)定溶液的吸光度，按照回歸方程計(jì)算溶液的質(zhì)量濃度，并按下式計(jì)算多糖得率：

T（%）=V×C×N/M0

式中，T為多糖得率;V為粗多糖溶液的體積;N為稀釋倍數(shù);C為多糖質(zhì)量濃度;M0為油茶籽餅粕粉末的質(zhì)量。

1.4提取單因素試驗(yàn)

取10g油茶籽餅粕粉末，固定料液比1∶10，浸提溫度40℃，浸提時(shí)間30min，分別在超聲時(shí)間為5、10、15、20、25min的條件下測(cè)定油茶籽餅粕粗多糖的得率。固定超聲時(shí)間5min，浸提溫度40℃，浸提時(shí)間30min，分別在料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的條件下測(cè)定油茶籽餅粕粗多糖的得率。固定超聲時(shí)間5min，料液比1∶10，浸提時(shí)間30min，分別在浸提溫度40、50、60、70、80℃的條件下測(cè)定油茶籽餅粕粗多糖的得率。固定超聲時(shí)間5min，料液比1∶10，浸提溫度40℃，分別在浸提時(shí)間30、60、90、120、150min的條件下測(cè)定油茶籽餅粕粗多糖的得率。

1.5提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)超聲時(shí)間、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間四因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.6油茶籽餅粕粗多糖的分離純化

1.6.1粗多糖前處理。

取冷凍干燥后的多糖適量，溶于水中，以Sevag法脫蛋白[14-15]，10%過氧化氫脫色后[16]，在經(jīng)3500Da透析袋流動(dòng)水透析48h，收集透析液，冷凍干燥后備用。

1.6.2DEAE纖維素陰離子樹脂的活化。取25gDEAE于燒杯中，加入250mL蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌均勻，靜置浸泡24h。將蒸餾水抽干，溶脹樹脂置于燒杯中，加入0.5mol/LHCl溶液，攪拌，靜置浸泡1.5h，抽干后用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性。再將溶脹樹脂置于燒杯中加入0.5mol/LNaOH溶液，攪拌，靜置浸泡1.5h，抽干后用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，待用。

47卷1期郭玉華等油茶籽餅粕多糖的提取工藝優(yōu)化及結(jié)構(gòu)鑒定

1.6.3裝柱與平衡。將層析柱洗凈固定于鐵架臺(tái)上，加入1/3體積的去離子水，將抽干的樹脂加入少量蒸餾水，超聲攪拌均勻后，迅速倒入層析柱中，直至樹脂填滿層析柱2/3左右，停止裝柱，并打開下部旋鈕，調(diào)整流速。保持柱子表面平整，以4倍柱體積的蒸餾水平衡后，關(guān)閉下部旋鈕，待用。

1.6.4上樣與純化。

將多糖液緩慢加入平衡好的DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂柱中（2.4cm×40cm），小心防止打亂上層平整的樹脂表層，上樣量為200mg。用0.3mol/LNaCl洗脫，每10mL接1管，洗脫60管。每管用苯酚硫酸法檢測(cè)并記錄溶液在495nm處的吸光度，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，洗脫體積為橫坐標(biāo)作洗脫曲線。合并吸光度峰值附近的洗脫液，冷凍干燥，得到精制多糖組分，并命名為CCP。

1.7CCP的紫外光譜掃描

稱取適量的油茶籽餅粕多糖CCP溶于蒸餾水中，制成5mg/mL多糖液，于190～800nm處進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.8CCP的單糖組成分析

1.8.1混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生。分別取100μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，與100μL的0.3mol/LNaOH溶液，置于1mL的具塞試管中，加入100μL0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）甲醇溶液后渦漩混勻。在80℃水浴反應(yīng)120min，冷卻至室溫;加100μL0.3mol/LHCl溶液中和。再加入1mL積氯仿，萃取3次，以除去未反應(yīng)的PMP，將下層水相用0.45μm濾膜過濾后，供HPLC進(jìn)樣分析[17-19]。

1.8.2樣品制備。

吸取100μL0.2mg/mL的CCP溶液于具塞試管中，加入100μL4mol/L三氟乙酸（TFA），充氮封管，114℃油浴2h;冷卻后加200mL甲醇，并用氮?dú)獯蹈伞Ｖ貜?fù)3次，加入100μL蒸餾水溶解用氮?dú)獯蹈傻乃舛嗵牵⒅糜?0mL具塞試管中，備用。然后按照1.8.1的衍生方法進(jìn)行處理。

色譜條件：色譜柱ZORBAXEclipseXBD-C18250mm×4.6mm5μm;流動(dòng)相：0.2mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.7）-乙腈（體積比83∶17）;柱溫：30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm;流速為1mL/min;進(jìn)樣體積20μL[17]。

2結(jié)果與分析

2.1提取單因素試驗(yàn)

由圖1可知，隨著超聲時(shí)間的增加，多糖的得率不斷提高，當(dāng)超聲時(shí)間增加到20min時(shí)，多糖的得率達(dá)到最高，之后隨著時(shí)間的增加，多糖得率上升并不明顯。故選擇超聲時(shí)間20min作為適宜的處理時(shí)間，并選擇10、15、20min作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

由圖2可知，隨著料液比例的增加，多糖的得率呈現(xiàn)先快速上升后趨于平緩的趨勢(shì)，比例為1∶25時(shí)多糖的得率達(dá)到最高之后不再增加。故選擇料液比例為1∶25時(shí)作為適宜的提取比例，并把料液比1∶15、1∶20、1∶25作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

由圖3可知，隨著浸提溫度的不斷升高，多糖的提取率不斷增大，當(dāng)浸提溫度達(dá)到70℃時(shí)，多糖的得率達(dá)到最高水平并趨于平穩(wěn)，但是浸提溫度為60和70℃時(shí)，多糖的提取率差異很小。故從經(jīng)濟(jì)和效率的角度考慮，以60℃作為適宜的浸提溫度，并把50、60、70℃作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

由圖4可知，隨著浸提時(shí)間的不斷增加，多糖的得率不斷提高，當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到120min時(shí)，多糖得率達(dá)到較高水平，并趨于平穩(wěn)。故把浸提時(shí)間120min作為適宜的提取時(shí)間，并以60、90、120min作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.2提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2、表3可以看出，各影響因素的極差與顯著性得出的結(jié)果基本一致。多糖得率影響因素的大小順序?yàn)镃>B>D>A，即浸提溫度>料液比>浸提時(shí)間>超聲時(shí)間。B、C和D3個(gè)因素對(duì)提取多糖得率均有較顯著的影響。其中浸提溫度對(duì)多糖得率的影響最大，一般來說溫度越高提取率越高，因?yàn)闇囟仍礁?，分子運(yùn)動(dòng)加快，滲透、溶解、擴(kuò)散速度加快，因而提取率提高[19]。但溫度過高，會(huì)破壞有效物質(zhì)的活性，增加雜質(zhì)的含量。超聲波可以起到破壁的作用，一定程度上促進(jìn)目標(biāo)物質(zhì)的溶出，但試驗(yàn)結(jié)果表明，過長(zhǎng)的超聲時(shí)間并不能持續(xù)促進(jìn)多糖的提取率提高。因此，超聲時(shí)間不宜過長(zhǎng)。故綜合考慮，最終確定最佳提取工藝條件為A1B2C2D3，即超聲時(shí)間10min，料液比1∶20，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間120min。按照此組合進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)得知，油茶籽餅粕多糖的平均得率為16.76%。高于表中的任意組合，因此認(rèn)為該工藝優(yōu)化合理，穩(wěn)定可行。

2.3油茶籽餅粕多糖的分離純化及鑒定DEAE-纖維素（二乙氨乙基纖維素，Dicthylaminoethyl）在纖維素上結(jié)合了帶正電荷的陽離子，可與帶負(fù)電荷的陰離子進(jìn)行交換，交換劑對(duì)多糖和無機(jī)陰離子均有交換吸附的能力，兩者同時(shí)存在于一個(gè)色譜過程中[20]。一般采用一定離子濃度的洗脫液和DEAE-纖維素交換劑洗脫達(dá)到分離多糖的目的。圖5為纖維素DEAE-52交換樹脂對(duì)油茶籽餅粕粗多糖的分級(jí)洗脫曲線。洗脫液為0.3mol/LNaCl溶液，收集尖峰及附近幾管洗脫液，冷凍干燥并命名為CCP。

由圖6可知，195nm左右處具有糖類物質(zhì)特征吸收峰[21]。其在260、280、420nm處并無顯著的吸收峰，已知的核酸、蛋白質(zhì)、多肽的吸收峰值分別是260、280、420nm[22]。說明所提取純化的多糖組分CCP較純，幾乎不含有蛋白質(zhì)核酸和多肽類雜質(zhì)。

糖類化合物一般常采用衍生化方法使其形成具有紫外或熒光吸收的衍生物來提高其在HPLC檢測(cè)中的靈敏度。已成功用于多糖化合物的單糖組成分析[23]。圖7為標(biāo)準(zhǔn)單糖的高效液相色譜圖，對(duì)比圖7，從圖8可以看出，PMP柱前衍生法高效液相色譜分析可知，多糖組分CCP其單糖組成為甘露糖、葡萄糖以及極少量的鼠李糖。測(cè)定結(jié)果與已知的報(bào)道大體一致。

3結(jié)論

試驗(yàn)選取超聲時(shí)間、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間4個(gè)因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過直觀分析和方差分析優(yōu)選工藝參數(shù)，結(jié)果表明，油茶籽餅粕多糖提取工藝優(yōu)化合理，得到的最佳優(yōu)化工藝參數(shù)為超聲時(shí)間10min，料液比1∶20，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間120min。在此條件下多糖的平均得率為16.76%。試驗(yàn)為油茶籽餅粕多糖提取提供了行之有效的方法。油茶籽餅粕多糖經(jīng)過DEAE-52纖維素陰離子交換柱層析得到純化組分CCP，梯度洗脫是多糖純化的主要手段之一，該試驗(yàn)選取0.3mol/LNaCl作為洗脫劑，進(jìn)一步研究可以擴(kuò)大NaCl的濃度范圍，以期獲得油茶籽餅粕中不同洗脫多糖組分。紫外和高效液相分析表明，在CCP為較純的均一多糖，其單糖組成較為單一，含有甘露糖和葡萄糖，其物質(zhì)的量比為1.91∶1.00。同時(shí)還含有極少量的鼠李糖。研究為開發(fā)利用油茶籽餅粕多糖提供了理論基礎(chǔ)。然而關(guān)于油茶籽餅粕多糖的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)表征還有待于更加深入的研究。

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