魏春霞，孫 淼，趙 煒，陳延飛，劉懷東，張 敏，李 嶺，陳 建，才學(xué)鵬*，曾巧英*，薛青紅*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081 )

伴隨我國居民生活水平的提高及膳食結(jié)構(gòu)的變化，牛肉、牛奶等產(chǎn)品市場(chǎng)需求旺盛，進(jìn)而促進(jìn)了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。牛布魯氏菌病、結(jié)核、炭疽、口蹄疫、病毒性腹瀉黏膜病、副流感、傳染性鼻氣管炎這幾種牛病常發(fā)病，威脅著這一產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，為了滿足民眾日常需求，減少養(yǎng)殖場(chǎng)和養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失，建立一種快速高效檢測(cè)這幾種牛病原的方法用以這些疾病的預(yù)防和防控十分必要。

牛布魯氏菌(Brucella, Bru)、結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)、炭疽桿菌(Anthrax)、口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus, FMDV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhoea virus, BVDV)、牛副流感病毒3型(Bovine para￣influenza virus, BPIV3)、牛傳染性支氣管炎病毒(Bovine infectious rhinotacheitus virus, IBRV)均易感牛，在不同程度上均可造成牛消瘦、母牛流產(chǎn)，甚至導(dǎo)致死亡。目前，常用的布病檢測(cè)方法有琥紅平板實(shí)驗(yàn)、凝集試驗(yàn)及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)；炭疽的檢測(cè)方法主要依賴微生物學(xué)及血清學(xué)方法，包括Ascoli氏反應(yīng)和PCR；結(jié)核的檢測(cè)常用過敏反應(yīng)等來鑒定；FMDV、BVDV、BPIV3、IBRV的檢測(cè)主要以病原分離、血清學(xué)試驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法為主。上述檢測(cè)方法均存在檢測(cè)指標(biāo)單一、操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等問題[1]，給牛群疫病診斷帶來一定困難。本文針對(duì)牛群主要發(fā)生疫病病原診斷方法存在的問題擬研究建立一種可以快速高效同時(shí)檢測(cè)七種牛疫病病原的基因芯片檢測(cè)技術(shù)，用于牛群疫病診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)所用檢測(cè)病原牛布魯氏菌疫苗、結(jié)核分支桿菌疫苗、炭疽芽孢桿菌弱毒苗、牛病毒性腹瀉病毒、牛副流感病毒、牛傳染性支氣管炎病毒、牛流行性熱病毒由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(IVDC)保存并提供，口蹄疫病毒疫苗由金宇保靈生物有限生物有限公司提供。所用臨床樣本采集自某養(yǎng)殖場(chǎng)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。實(shí)驗(yàn)用病原信息見表1。

表1 病原信息Tab 1 Pathogens information

1.1.1 主要試劑 核酸提取試劑盒AXYGEN Axyprep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-Script One Step RT-PCR Kit Ver2(TaKaRa)，PMD 18-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)，TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，MakerII(康為世紀(jì))，2×Taq MasterMix、普通質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，SA-HRP(Jackson)，PierceTM1-Step Ultra TMB Biotting Solution (Thermo)。

1.2 方法的建立

1.2.1 引物探針的設(shè)計(jì) 以布魯氏菌的外膜蛋白(OMP25)保守序列為靶基因設(shè)計(jì)引物；以炭疽芽孢桿菌的POX1質(zhì)粒和16SrDNA基因片段為模板設(shè)計(jì)引物探針；參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)牛結(jié)核分枝桿菌引物及探針;副流感病毒N蛋白常作為分子診斷的靶基因,針對(duì)N基因設(shè)計(jì)引物及探針[3];IBRV有四類糖蛋白，針對(duì)gB蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物探針[4]；BVDV E2基因是病毒的主要保護(hù)性抗原編碼基因，在E2基因的5'端是不同毒株的主要變異區(qū)域,故選擇BVDV 5'-非翻譯區(qū)(5'-Untranslated region, 5'-UTR)設(shè)計(jì)引物和探針[5]；比較FMDV全基因組進(jìn)行多序列比較，發(fā)現(xiàn)FMDV 7個(gè)血清型的保守基因是3D基因，進(jìn)而根據(jù)該保守序列設(shè)計(jì)引物及探針。以上引物設(shè)計(jì)及性能評(píng)價(jià)用oligo7軟件。引物探針具體信息見表2和表3。

1.2.2 芯片的制備 探針用磷酸緩沖液稀釋至終濃度為6 μmol/L，設(shè)置點(diǎn)樣儀參數(shù)為100 drop，按照點(diǎn)樣順序?qū)⒏魈结橖c(diǎn)樣于納米膜上。點(diǎn)樣后將膜基片置于濕度為40%～60%，溫度為22～25 ℃條件下過夜晾干，2～8 ℃存放。芯片點(diǎn)樣模式見圖1。

表2 引物信息Tab 2 Primers information

表3 探針信息Tab 3 Probes information

Biotin、IC-1、IC-2為陽性質(zhì)控點(diǎn)，Buffer為陰性質(zhì)控點(diǎn)圖1 芯片點(diǎn)樣模式Fig 1 The chip spotting model

1.2.3 單一病原核酸的提取、擴(kuò)增 參照核酸提取試劑盒說明書提取各病原的核酸，優(yōu)化退火溫度等PCR反應(yīng)條件。將BPIV3、BVDV、FMDV核酸(遺傳物質(zhì)為RNA)，Brucella、IBRV、MTB、Anthrax核酸(遺傳物質(zhì)為DNA)分別按常規(guī)體系擴(kuò)增。反應(yīng)條件分別為50 ℃ 30 min，94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min；94℃ 5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。

1.2.4 混合樣品核酸的擴(kuò)增 應(yīng)用多重PCR方法對(duì)混合樣品核酸進(jìn)行擴(kuò)增，通過對(duì)其退火溫度、引物用量等反應(yīng)條件優(yōu)化后，將樣品核酸按表4體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為50 ℃ 30 min，94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 1 min，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。

表4 混合樣品核酸擴(kuò)增體系Tab 4 Mixed sample nucleic acid amplification system

1.2.5 基因芯片的雜交、洗滌與可視化檢測(cè) 取20 μL PCR產(chǎn)物，加入到100 μL的雜交液中，沸水浴5 min后加入到已47 ℃預(yù)熱芯片中,200 r/min 反應(yīng)20 min。棄去反應(yīng)液后用47 ℃預(yù)熱的洗滌液，200 μL/孔淋洗三遍,47 ℃孔板孵育器洗10 min。雜交液1∶2000稀釋SA-HRP，100 μL/孔，200 r/min，室溫反應(yīng) 10 min。洗滌液室溫淋洗2次，每孔加入60 μL TMB避光顯色。拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6 結(jié)果判定 陰性質(zhì)控點(diǎn)不顯色，陽性質(zhì)控點(diǎn)的顏色為明顯強(qiáng)于陰性質(zhì)控點(diǎn)的藍(lán)紫色，兩個(gè)陽性質(zhì)控點(diǎn)至少有一個(gè)顯色為有效實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如被測(cè)樣品所在探針點(diǎn)不顯色，即為陰性；如果被測(cè)樣品所在探針點(diǎn)為藍(lán)紫色，則為陽性。

1.2.7 引物的特異性試驗(yàn) 將各病原樣品擴(kuò)增后，2%瓊脂糖凝膠電泳。將膠回收產(chǎn)物送往華大基因公司測(cè)序。

1.2.8 探針的特異性試驗(yàn) 將七種病原、健康牛血清、牛流行性熱病毒，分別按照1.2.4擴(kuò)增后進(jìn)行芯片檢測(cè)。

1.2.9 芯片的靈敏度試驗(yàn) 各病原PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳之后，將膠回收產(chǎn)物連接pMD 18-T Vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP 10感受肽細(xì)胞中，涂板，選取大小適中的單個(gè)菌落培養(yǎng)，菌液PCR后，將PCR陽性的菌液送往測(cè)序公司測(cè)序。使用DNA Star和NCBI Blast分析測(cè)序結(jié)果，同時(shí)將測(cè)序成功的陽性菌液擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。將各陽性質(zhì)粒定量后10倍倍比稀釋，擴(kuò)增后分別與芯片反應(yīng),進(jìn)行單一陽性質(zhì)粒靈敏度檢測(cè)同時(shí)對(duì)其進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。再將七種病原質(zhì)粒等濃度體積混合，10倍倍比稀釋，擴(kuò)增后與芯片雜交,進(jìn)行七種陽性質(zhì)粒混合靈敏度測(cè)定。

1.2.10 芯片的保存期試驗(yàn) 將濃度為1.4×10-4ng/μL的七種病原陽性混合質(zhì)粒按照步驟1.2.4擴(kuò)增，與在2～8 ℃保存30 d、60 d、120 d、180 d的芯片分別進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.11 芯片的重復(fù)性檢測(cè) 將同一質(zhì)控樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物用不同批次及同一批次內(nèi)不同芯片進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.12 芯片檢測(cè)臨床樣品與國標(biāo)方法檢測(cè)的比對(duì)

將23份牛血清、4份牛肺組織、3份牛腸組織臨床樣品提取核酸后，按照1.2.4方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片反應(yīng)后記錄檢測(cè)結(jié)果，芯片反應(yīng)操作同1.2.5。同時(shí)將各臨床樣本參照《奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)NY/T 1467-2007》、《動(dòng)物炭疽診斷技術(shù)NY/T 561-2015》、《結(jié)核病病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法GB/T 27639-2011》、《口蹄疫檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T 1181-2010》、《牛病毒性腹瀉/粘膜病檢疫規(guī)范 SN/T 1129-2007》、《牛傳染性鼻氣管炎檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T 1164.1-2011》及中和試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的特異性評(píng)價(jià) 各病原擴(kuò)增產(chǎn)物大小與前期設(shè)計(jì)一致(圖2)，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)目的片段相同。

M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: 結(jié)核桿菌; 2: 牛副流感病毒3型; 3: 牛病毒性腹瀉病毒; 4: 炭疽-16SrDNA; 5: 炭疽-POX1; 6,7: 牛傳染性鼻氣管炎病毒; 8-11: 口蹄疫病毒; 12-15：布魯氏菌M: MakerII; 1: MTB; 2: BPIV3; 3: BVDV; 4: Anthrax-16SrDNA; 5: Anthrax-POX1;6,7: IBRV; 8-11: FMDV; 12-15: Brucella圖2 PCR產(chǎn)物示意圖Fig 2 Schematic diagram of PCR product

2.2 探針的特異性評(píng)價(jià) 陰性質(zhì)控點(diǎn)無響應(yīng)，陽性質(zhì)控點(diǎn)響應(yīng)，各病原探針點(diǎn)特異性響應(yīng)。健康牛血清、牛流行性熱病毒除陽性質(zhì)控點(diǎn)響應(yīng)外，其他探針均無響應(yīng)(圖3)，表明所設(shè)計(jì)探針特異性良好。

1: 牛副流感病毒3型; 2: 牛病毒性腹瀉病病毒; 3: 口蹄疫病毒; 4: 傳染性鼻氣管炎病毒; 5: 炭疽-POX1; 6: 炭疽-16SrDNA; 7: 布魯氏菌; 8: 結(jié)核桿菌; 9: 健康牛血清; 10: 牛流行性熱病毒 1: BPIV3; 2: BVDV; 3: FMDV; 4: IBRV; 5: Anthrax-POX1; 6: Anthrax-16SrDNA; 7: Brucella; 8: MTB; 9: Healthy bovine serum; 10: Bovine epizotic fever virus圖3 探針特異性響應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 3 Probe specificity test results

2.3 芯片的靈敏度評(píng)價(jià)

2.3.1 單一陽性質(zhì)粒靈敏度 單一陽性質(zhì)粒芯片檢測(cè)靈敏度可達(dá)1.0 ×10-6ng/μL，比普通PCR高出10～100倍(表5)。

2.3.2 混合陽性質(zhì)粒靈敏度 當(dāng)混合陽性質(zhì)粒稀釋至濃度為1.4×10-5ng/μL時(shí)，各病原探針點(diǎn)與陽性質(zhì)控點(diǎn)均顯色，陰性質(zhì)控點(diǎn)無顯色。濃度為1.4×10-6ng/μL時(shí)，陽性質(zhì)控點(diǎn)正常顯色，陰性質(zhì)控點(diǎn)無顯色，病原探針點(diǎn)只有MTB、Anthrax有響應(yīng)(圖4)。故七種病原混合陽性質(zhì)粒芯片檢測(cè)靈敏可達(dá)1.4×10-5ng/μL。

2.4 芯片的保存期評(píng)價(jià) 同一擴(kuò)增產(chǎn)物與2～8 ℃保存了30 d、60 d、120 d、180 d的芯片反應(yīng)后，陽性質(zhì)控點(diǎn)及七種病原對(duì)應(yīng)探針點(diǎn)均有顯色(圖5)，表明在2～8 ℃，芯片至少可保存180 d。

表5 單一病原質(zhì)粒檢測(cè)靈敏度Tab 5 Sensitivity of the single pathogen plasmid ng/μL

1: 1.4×10-1 ng/μL; 2: 1.4×10-2 ng/μL; 3: 1.4×10-3 ng/μL; 4: 1.4×10-4 ng/μL; 5: 1.4×10-5 ng/μL; 6: 1.4×10-6 ng/μL; 7: 1.4×10-7 ng/μL; 8: Blank control圖4 混合樣品靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig 4 Mixed sample sensitivity experiment results

1: 30 days; 2: 60 days; 3: 120 days; 4:180 days圖5 不同保存期實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 5 The results of different storage experiment

2.5 芯片的重復(fù)性評(píng)價(jià) 用同一批樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物與同一批次及不同批次的芯片進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針對(duì)同一樣品，同一批次及不同批次的芯片的檢測(cè)結(jié)果均相同。芯片的可重復(fù)性為100%。

2.6 臨床樣本的檢測(cè) 30份牛樣品經(jīng)芯片檢測(cè)，其中Brucella檢出1份，BPIV3檢出7份，BVDV檢出10份，IBRV檢出11份，Anthrax、MTB、FMDV未檢出。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)Brucella檢出1份，BPIV3檢出7份，BVDV檢出12份，IBRV檢出10份，Anthrax、MTB、FMDV未檢出。其中單一病原感染占63.3%，兩種病原混合感染比例為36.7%。兩種檢測(cè)方法符合率為98.6%。具體數(shù)據(jù)見表6。

表6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Tab 6 Results of clinical samples

+：陽性；-：陰性

3 討論與結(jié)論

基因芯片技術(shù)近些年來被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并在基因功能表達(dá)、致病機(jī)理、臨床診斷、藥物開發(fā)等研究方面取得突出成效[6]。目前針對(duì)這七種牛群常發(fā)病病原，國內(nèi)檢測(cè)方法一般為病毒分離試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)等方法。此類傳統(tǒng)方法都需要耗費(fèi)較多的人力和時(shí)間，每次只能檢測(cè)一種病原。本實(shí)驗(yàn)所研制的基因芯片檢測(cè)方法具有操作簡單，快速、便捷、高通量等特點(diǎn)。

基因芯片檢測(cè)技術(shù)一般包括芯片的制備，樣品的制備，樣品與芯片的生物反應(yīng)以及反應(yīng)信號(hào)的檢測(cè)與分析等[7]。本研究建立的基因芯片方法以“0+X”納米膜為支撐，與通常醛基化玻片為支撐的芯片檢測(cè)方法相比可大大縮短雜交、洗滌、顯色等芯片反應(yīng)各步驟的時(shí)間,本檢測(cè)方法僅需3 h，而采用醛基化玻片的芯片則需要至少5 h[8-10]。在樣品制備方面，根據(jù)各病原的特異性保守區(qū)域設(shè)計(jì)探針引物。據(jù)文獻(xiàn)可知探針大小及靶DNA的長度等因素會(huì)影響雜交信號(hào)[11]，本實(shí)驗(yàn)各探針長度均在25 bp左右，各靶基因的目標(biāo)片段均在80～150 bp，保證了響應(yīng)信號(hào)的穩(wěn)定清晰。生物素與鏈霉親和素有良好的親和性[12]，用5'端標(biāo)記生物素的引物來擴(kuò)增目的片段，探針與帶有生物素的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后再與HRP標(biāo)記的鏈霉親和素反應(yīng)，最后在底物顯色液的作用下，探針點(diǎn)可顯現(xiàn)出肉眼可見的藍(lán)紫色響應(yīng)點(diǎn)。方便肉眼觀察，且不需要復(fù)雜儀器來記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)該方法在點(diǎn)樣時(shí)設(shè)置了三個(gè)陽性質(zhì)控點(diǎn)及1個(gè)陰性質(zhì)控點(diǎn)，用以監(jiān)測(cè)操作過程的各步驟是否有效，保證檢測(cè)結(jié)果可靠性。

利用多重PCR擴(kuò)增特異性片段，引物濃度及引物間相互作用會(huì)影響擴(kuò)增效率[13]。將七種病原的八對(duì)引物排列組合后進(jìn)行雙重PCR，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的炭疽的兩對(duì)引物和口蹄疫的引物對(duì)其他五種病原的擴(kuò)增效率影響較大，但對(duì)他們自身擴(kuò)增沒有影響，故將這兩種病原分開進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)各引物的最佳濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立完整的擴(kuò)增體系。芯片反應(yīng)溫度對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果有一定影響，優(yōu)化芯片反應(yīng)溫度可得47 ℃為最佳芯片反應(yīng)溫度。對(duì)陽性質(zhì)控質(zhì)粒的濃度進(jìn)行優(yōu)化，使其在檢測(cè)樣品不同濃度下可一直響應(yīng)，同時(shí)不影響樣品擴(kuò)增的靈敏度。最終確定其濃度為1.0×10-3ng/μL時(shí)為最佳用量。

在確定的最優(yōu)條件下，該基因芯片單一病原檢測(cè)靈敏度可達(dá)1.0×10-6ng/μL，比普通PCR檢測(cè)方法靈敏10～100倍，對(duì)七種混合病原的檢測(cè)靈敏度達(dá)到1.4×10-5ng/μL。楊帆[14]建立了一種BPIV3、IBRV、BVDV和Mycoplasmabovis多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)BPIV3和BVDV最低檢測(cè)量分別為100 pg和1 ng，對(duì)IBRV和Mycoplasmabovis的最低檢測(cè)量分別為10 pg和100 pg。

基因芯片檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用提高了感染性疾病分子診斷的質(zhì)量，同時(shí)縮短了分析時(shí)間，是一種獨(dú)立的可以篩選大量病理標(biāo)本中多個(gè)基因的方法[15-17]。用基因芯片方法與用國標(biāo)方法同時(shí)檢測(cè)30份臨床樣品，符合率為98.6%。本研究所建立的方法可同時(shí)檢測(cè)牛七種病原，七種病原間無交叉響應(yīng)，與牛其他病原及健康牛血清組織也無響應(yīng)，芯片重復(fù)率可達(dá)100%，2～8 ℃保存期可達(dá)180 d，完全可以滿足實(shí)驗(yàn)室臨床樣品檢測(cè)及流行病學(xué)監(jiān)察。