賈艾玲，王仁廣，董雪蓮，董金香，趙紅迪，邱智東*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥有效成分省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130117；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137)

黃柏廣泛應(yīng)用于獸藥及中藥領(lǐng)域，《中國(guó)藥典》2015版一部規(guī)定關(guān)黃柏為蕓香科植物黃檗PhellodendronamurenseRupr. 的干燥樹(shù)皮，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡的功效，常用于濕熱瀉痢，黃疸尿赤，帶下陰癢，熱淋澀痛等癥[1]。最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被譽(yù)為清熱燥濕藥中的上品，臨床療效突出，應(yīng)用廣泛。主要含有生物堿類(lèi)、酚酸類(lèi)、檸檬苦素類(lèi)等化學(xué)成分，具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、誘導(dǎo)特異性免疫耐受、神經(jīng)保護(hù)等作用[2-3]。以黃柏為主要組成制成的三黃散、復(fù)方黃柏顆粒等也廣泛用于獸藥、中藥領(lǐng)域。關(guān)黃柏藥源黃檗是我國(guó)東北地區(qū)著名的三大珍貴闊葉樹(shù)種之一，主要分布在黑龍江省中東部、吉林省大部分區(qū)域、遼寧省東南部等[4]，20世紀(jì)60年代以來(lái)，由于藥農(nóng)盜剝、濫剝樹(shù)皮，伐木毀林、開(kāi)山筑路及自然災(zāi)害等原因?qū)е玛P(guān)黃柏野生資源瀕臨枯竭，產(chǎn)量逐年銳減[5]。1999年被《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物；2004年被《中國(guó)植物紅色名錄》定為易危物種；2008年被評(píng)定為容易消失種[6-7]。黃檗資源的保護(hù)問(wèn)題已引起高度重視。關(guān)黃柏的制取大多是采用環(huán)剝法，剝?nèi)?0年以上的黃檗樹(shù)皮而得，一般每棵樹(shù)時(shí)隔至少4年才能再次剝?nèi)?，產(chǎn)量在20公斤左右。關(guān)黃柏的年產(chǎn)量與實(shí)際需求量嚴(yán)重失衡，供不應(yīng)求的問(wèn)題越發(fā)凸顯[8]。與黃檗共稱(chēng)為“三大木本植物藥”的厚樸和杜仲，在藥源高值化利用方面已有研究[9-11]。為了提高關(guān)黃柏藥源黃檗樹(shù)的開(kāi)發(fā)與利用，本文以吉林省渾江市靖宇縣地產(chǎn)黃檗為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法、指紋圖譜結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)不同生長(zhǎng)年限的黃檗樹(shù)枝與關(guān)黃柏藥材的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究[12-14]，探討瀕危物種黃檗的樹(shù)枝代替樹(shù)皮作為中藥、獸藥和工業(yè)原料的可能性，為資源的可持續(xù)利用提供新的思路和途徑。

1 材 料

1.1 儀器 Agilent1220高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；SHIMADZU8040質(zhì)譜儀(日本島津公司)；EL-204型十萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)梅特勒-托利多公司)；TG328A(S)分析天平(上海精科分析儀器廠)；DZF-6094真空干燥箱(上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器總廠)；TP-150 超聲波清洗機(jī)(天鵬電子新技術(shù)有限公司)。

1.2 試劑與藥材 鹽酸小檗堿(110713-201212)、鹽酸巴馬汀(110732-201108)、鹽酸藥根堿(110733-201108)、鹽酸黃柏堿(111895-201202)對(duì)照品均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院；木蘭花堿(MUST-14122416)對(duì)照品購(gòu)自于成都曼思特生物科技有限公司，以上所有對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>98%；色譜乙腈、色譜甲醇(Fisher公司)，其他試劑均為分析純(北京化工廠)。關(guān)黃柏藥材、黃檗樹(shù)樹(shù)枝樣品均經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與鑒定教研室張強(qiáng)副教授鑒定為蕓香科植物黃檗PhellodendronamurenseRupr.的干燥樹(shù)皮或樹(shù)枝。樣品采集信息見(jiàn)表1。

表1 樣品采集信息Tab 1 Sampling information

2 方 法

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A相為乙腈-B相為0.1%磷酸溶液(加入磷酸二氫鈉使其達(dá)到0.02 mol/L的濃度)，梯度洗脫(0～15 min，14%A；15～30 min，14%～30%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為對(duì)照品溶液5 μL，供試品溶液10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量，加60%乙醇分別制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液；精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加60%乙醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液；分別取上述五種對(duì)照品溶液各1 mL制成混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取黃檗樹(shù)枝粉末(分別為三年、四年、七年、八年的黃檗樹(shù)生長(zhǎng)一年的樹(shù)枝)、關(guān)黃柏藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)各約0.2 g，精密稱(chēng)定，置50 ml量瓶中，加入60%乙醇40 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)45 min，放冷，加60%乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為0.5005 mg/mL的鹽酸黃柏堿、0.501 mg/mL木蘭花堿、0.5005 mg/mL鹽酸藥根堿、0.5000mg/mL的鹽酸巴馬汀、5.005 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液0.5、1、2、5、8、10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸并計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r)，結(jié)果見(jiàn)表2。

1.鹽酸黃柏堿 2.木蘭花堿 3.鹽酸藥根堿 4.鹽酸巴馬汀 5.鹽酸小檗堿圖1 混合對(duì)照品(A)及供試品(B)HPLC色譜圖Fig 1 HPLC of mixed reference substances(A) and samples (B)

序號(hào)指標(biāo)成分線(xiàn)性回歸方程線(xiàn)性范圍/μgr1鹽酸黃柏堿Y=31.282X+9.56620.2503～5.0051.00002木蘭花堿Y=57X+2.85770.2505～5.0100.99993鹽酸藥根堿Y=143.31X-1.60750.2503～5.0050.99994鹽酸巴馬汀Y=271.77X-6.61080.2500～5.0000.99995鹽酸小檗堿Y=97.294X+3.17522.5025～50.051.0000

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積積分值，計(jì)算鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿的峰面積RSD值分別為0.15%、0.14%、0.20%、0.18%、0.17%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一關(guān)黃柏藥材供試品溶液，于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積積分值，計(jì)算RSD。結(jié)果鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿的RSD分別為1.09%、1.39%、1.08%、0.11%、0.09%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次樣品(S1)，照2.3項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，分別精密吸取10 μL，進(jìn)樣，計(jì)算鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.20%、0.30%、0.08%、0.30%、2.09%；RSD分別為 1.43%、0.42%、0.39%、0.29%、0.28%。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取6份已知含量的S1樣品約0.1 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的加樣回收率分別為92.29%、98.87%、103.91%、97.77%、96.78%；RSD分別為 1.78%、2.04%、0.63%、2.74%、2.65%，均符合要求。

2.5 樣品的含量測(cè)定 取S1-S5樣品各50 g，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行5種成分的含量分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 5批樣品中5種生物堿類(lèi)成分的含量測(cè)定結(jié)果Tab 3 Determination of five alkaloids in five batches of samples

圖2 含量測(cè)定結(jié)果圖Fig 2 Content determination result diagram

2.6 指紋圖譜的建立與相似度分析 取5批樣品適量，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)，利用中位數(shù)法生成HPLC指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜，并生成共有模式圖，進(jìn)行相似度計(jì)算，見(jiàn)表4。結(jié)果除樣品S5以外，其他樣品的相似度為0.940～0.982，相似度良好。說(shuō)明不同年限黃檗樹(shù)枝中整體化學(xué)成分的含量有一定差異，但隨著生長(zhǎng)年限的增加其相似度也增加。結(jié)果表明，八年樹(shù)枝與關(guān)黃柏藥材的相似度最高，具有藥源高值化利用價(jià)值。

通過(guò)對(duì)建立的指紋圖譜的共有峰進(jìn)行標(biāo)定，得到6個(gè)共有峰，確認(rèn)峰1為鹽酸黃柏堿、峰2為木蘭花堿、峰4為鹽酸藥根堿、峰5為鹽酸巴馬汀、峰6為鹽酸小檗堿。根據(jù)質(zhì)譜法對(duì)未知成分分析，未知成分峰3為三個(gè)未知化合物，m/z均為367[M-H]-。通過(guò)查閱相關(guān)種屬植物文獻(xiàn)報(bào)道的化學(xué)成分[15-16]，初步推斷結(jié)果可知，關(guān)黃柏藥材中未知成分由三個(gè)同分異構(gòu)體組成，分別為3-O-阿魏酰奎寧酸、4-O-阿魏酰奎寧酸和5-O-阿魏?？鼘幩幔四陿?shù)枝中未知成分中則不含5-O-阿魏?？鼘幩幔?jiàn)圖3、圖4。

表4 相似度分析結(jié)果Tab 4 Results of similarity analysis

圖3 關(guān)黃柏藥材與不同年限黃檗樹(shù)枝的指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜Fig 3 Fingerprint and control of Phellodendron mandshurica and its branches in different years

圖4 關(guān)黃柏藥材與八年樹(shù)枝對(duì)照?qǐng)D譜Fig 4 Comparative atlas of Phellodendron mandshurica and its eight year branches

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件及方法的優(yōu)選 參照2015版《中國(guó)藥典》一部關(guān)黃柏項(xiàng)下含量測(cè)定方法，在345 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，鹽酸黃柏堿不出峰。故參照2015版《中國(guó)藥典》一部黃柏項(xiàng)下黃柏堿的的測(cè)定方法，波長(zhǎng)改為284 nm。在此波長(zhǎng)下檢測(cè)鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿5種生物堿對(duì)照品都出峰，但對(duì)照品峰分不開(kāi)，需要調(diào)整流動(dòng)相比例。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，增大水相比例可以使峰分開(kāi)，增大有機(jī)相比例出峰時(shí)間會(huì)提前。最終確定流動(dòng)相比例為0～15 min，流動(dòng)相A的比例為14%，流動(dòng)相B的比例為86%；15～30 min，流動(dòng)相A的比例為30%，流動(dòng)相B的比例為70%。經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察，該方法穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性好，符合要求，可用于同時(shí)測(cè)定關(guān)黃柏藥材中鹽酸黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿5種生物堿的含量。

3.2 生長(zhǎng)年限與指標(biāo)成分含量分析 根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果可知，隨著年限增長(zhǎng)，樹(shù)枝中各個(gè)活性成分的含量逐年遞增。八年樹(shù)枝各組分含量與關(guān)黃柏藥材最為相近，與關(guān)黃柏藥材中均含5種生物堿，其中鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量與關(guān)黃柏藥材相近；黃檗樹(shù)枝中木蘭花堿含量豐富，七年樹(shù)枝中含量已超過(guò)藥材，八年樹(shù)枝中含量是關(guān)黃柏藥材中含量的8.6倍，該結(jié)果可為進(jìn)一步對(duì)其生物活性等方面的研究提供理論依據(jù)。

3.3 相似度比較分析 對(duì)于相似度的比較，有文獻(xiàn)將共有峰面積分別錄入Excel表格中，通過(guò)夾角余弦以及其它參數(shù)來(lái)計(jì)算不同數(shù)據(jù)間的相似度。但該法存在較多缺陷，不僅計(jì)算方法過(guò)于復(fù)雜，且在評(píng)價(jià)相似度時(shí)也需考慮較多因素。采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件可以達(dá)到快速、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)的目的。通過(guò)高效液相色譜法只能測(cè)定已知5種對(duì)照品的含量，不能全面地對(duì)它們進(jìn)行比較；但通過(guò)相似度比較法對(duì)八年樹(shù)枝與關(guān)黃柏藥材的色譜圖進(jìn)行對(duì)比，就可以更加全面地比較它們之間的相似關(guān)系，結(jié)果表明，八年樹(shù)枝和關(guān)黃柏藥材與其共有模式之間的相似度均達(dá)到0.96以上，說(shuō)明相似度較高，可以為關(guān)黃柏藥源高值化研究提供理論基礎(chǔ)。

3.4 未知成分的質(zhì)譜分析 傳統(tǒng)的關(guān)黃柏藥材成分分析方法為高效液相色譜法，主要檢測(cè)成分為生物堿類(lèi)，然而在特定紫外波長(zhǎng)下，有些成分很難檢出，而這些成分在關(guān)黃柏藥材和八年樹(shù)枝中含量較高，可作為藥材替代品選擇依據(jù)和質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分進(jìn)行研究。試驗(yàn)采用質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)提取離子模式(EIC)對(duì)關(guān)黃柏藥材和八年樹(shù)枝的成分進(jìn)行分析表明，八年樹(shù)枝只含有化合物3-O-阿魏?？鼘幩岷?-O-阿魏?？鼘幩?，而5-O-阿魏?？鼘幩岬暮繋缀醪豢蓹z出，可作為區(qū)分關(guān)黃柏藥材和八年樹(shù)枝的主要依據(jù)。

本文建立同時(shí)測(cè)定關(guān)黃柏中5種化學(xué)成分的HPLC方法，并結(jié)合相似度比較法、質(zhì)譜法對(duì)不同年限的黃檗樹(shù)枝與關(guān)黃柏藥材進(jìn)行較全面的研究。研究表明黃檗樹(shù)枝與關(guān)黃柏藥材主要成分較為相近，且八年黃檗樹(shù)枝中成分組分及含量與關(guān)黃柏藥材最為相近，可為關(guān)黃柏藥源在中藥、獸藥等領(lǐng)域的高值化利用提供一定的理論依據(jù)。