楊睿，時(shí)冉冉

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462000）

0 引言

乳腺癌是一種多發(fā)的女性疾病，近年來發(fā)病率逐年上升，2012年國家疾控中心的調(diào)查結(jié)果顯示乳腺癌的發(fā)病率為42.55%，居女性惡性腫瘤的首位[1]。乳腺癌病因復(fù)雜，晚育、酗酒、基因等都是與之相關(guān)的因素。化療是常用的乳腺癌治療方法，但對身體的副作用大。維生素E琥珀酸酯是一種新型抗癌藥物，副作用小，能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋零。本文探究維生素E琥珀酸酯聯(lián)合化療藥物對乳腺癌增殖的抑制作用，旨在為乳腺癌臨床用藥提高實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

本實(shí)驗(yàn)使用到的材料有維生素E琥珀酸酯（VES）、絲裂霉素(MMC)、環(huán)磷酰胺(CTX)、人乳腺癌細(xì)胞株Bcap-37，其中維生素E琥珀酸酯的生產(chǎn)廠家為SIGMA公司，絲裂霉素的生產(chǎn)廠家為浙江海正藥業(yè)股份有限公司，環(huán)磷酰胺的生產(chǎn)廠家為上海華聯(lián)制藥有限公司，MTT的生產(chǎn)廠家為AMRESCO,人乳腺癌細(xì)胞株Bcap-37購自中科院上海細(xì)胞所。

1.2 方法

把Bcap-37細(xì)胞置于含10%牛血清的RPMI1640的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，環(huán)境溫度設(shè)置為37℃，二氧化碳濃度為5%。用無水乙醇溶解維生素E琥珀酸酯，濃度設(shè)置為20μg/mL。溶解CTX、MMC，濃度分別設(shè)定為:300μg/mL、3.3μg/mL。把人乳腺癌細(xì)胞株 Bcap-37分為3組，分別加入維生素E琥珀酸酯、環(huán)磷酰胺及絲裂霉素，作用24h、36h后觀察Bcap-37的生長狀況[2]。并設(shè)置一組不加任何藥物的含人乳腺癌細(xì)胞株Bcap-37的培養(yǎng)基作為對照組。

1.3 檢測項(xiàng)目及方法

1.3.1 乳腺癌細(xì)胞增殖檢測

接種人乳腺癌細(xì)胞株Bcap-37，將其置于96孔板上，每個孔注入濃度為2×104/mL的Bcap-37細(xì)胞株200μL，此外，每組設(shè)置6個復(fù)孔。細(xì)胞接種后24h在孔板上加入不同濃度的VES、CTX及MMC進(jìn)行藥物處理，之后再加入濃度為5g/L的MTT，每個孔中加入20μL。孵箱溫度保持在37℃，培養(yǎng)4h之后除去孔中的上清液，再加入DMSO，每孔加入150μL。之后把孔板置于震蕩臺上震蕩5min，使用自動酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，并測定細(xì)胞的吸光值A(chǔ)（492nm）。最后通過吸光值測定出不同濃度、種類的藥物對Bcap-37細(xì)胞的生長抑制率[3]。計(jì)算公式為:抑制率（%）=（對照組平均吸光值A(chǔ)-實(shí)驗(yàn)組平均吸光值A(chǔ)）/對照組平均吸光值A(chǔ)×100%。

1.3.2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

把Bcap-37細(xì)胞接種于6孔板上，細(xì)胞濃度為5×104。并加入 20μg/mLVES 和 3.3μg/mL 的 MMC，或者是 20μg/mLVES的 300μg/mLCTX，作用 24h后，將培養(yǎng)液離心處理，去除培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸濁液。并在懸濁液中加入70%冰乙醇，之后再加入PI，溫度保持在4℃，置于黑暗處30min。并設(shè)置未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞作為對照。最后將細(xì)胞懸濁液進(jìn)行上機(jī)分析，每個標(biāo)本設(shè)置為10000個細(xì)胞，分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面Fas表達(dá)

把Bcap-37細(xì)胞接種于6孔板上，細(xì)胞濃度為5×104。并加入 20μg/mLVES 和 3.3μg/mL 的 MMC，或者是 20μg/mLVES的 300μg/mLCTX，作用 24h后，將培養(yǎng)液離心處理，去除培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸濁液。之后在細(xì)胞懸濁液中加入PE標(biāo)記的FAS抗體靜置30min，并使用PBS漂洗3次[4]，最后使用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采取SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對本文數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料用n、%表示，組間比較采用t、χ2檢驗(yàn)，當(dāng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 VES與化療藥物聯(lián)合對與乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用

單一使用VES、MMC、CTX對乳腺癌細(xì)胞生長的抑制作用在24、36h內(nèi)分別為:38.47%、52.73%；59.06%、64.25%；28.85%、46.91%。VES與 化 療 藥物聯(lián)合使用對乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用明顯增強(qiáng)，分別為76.70%、90.14%；64.13%、80.88%。與使用單一藥物相比，明顯增強(qiáng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（與MMC相比作用不顯著）。

2.2 VES與化療藥物聯(lián)合對癌細(xì)胞凋亡率的影響

Bcap-37細(xì)胞的自然凋亡率為0.7%，單獨(dú)使用VES、MMC、CTX時(shí)Bcap-37細(xì)胞的凋亡率在24h內(nèi)分別為:19.2%、16.7%、12.3%。VES與化療藥物MMC、CTX聯(lián)合使用時(shí)，Bcap-37細(xì)胞的凋亡率在24h內(nèi)分別提高到4.8%、39.6%。

2.3 乳腺癌細(xì)胞表面Fas表達(dá)受VES聯(lián)合化療藥物的影響

對照組的乳腺癌細(xì)胞表面Fas表達(dá)平均熒光強(qiáng)度和陽性率分別為4.09、92.5%。經(jīng)VES與化療藥物MMC、CTX聯(lián)合處理后，其平均熒光強(qiáng)度和陽性率分別為:22.0、100%；18.7、100%。

表1 VES、MMC、CTX單獨(dú)使用與聯(lián)合作用與癌細(xì)胞A值、抑制率的關(guān)系

3 討論

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，占女性腫瘤發(fā)病率的31%，嚴(yán)重威脅著女性的健康，常用的治療方法有藥物治療和手術(shù)治療。研究表明[5]，化療藥物聯(lián)合使用對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)。醫(yī)學(xué)界常常使用引用新藥物的辦法來提高化療的有效性，維生素E琥珀酸酯是一種新型藥物。Turley等人發(fā)現(xiàn)維生素E琥珀酸酯能夠產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)，使淋巴瘤細(xì)胞凋亡。隨后人們對其開始了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)它不僅僅能使淋巴瘤細(xì)胞凋亡，對胃癌、前列腺癌、乳腺癌等上皮組織來源的惡心腫瘤都有十分有效的誘導(dǎo)凋亡作用。常用的化療藥物副作用大，會對人體造成較大傷害，尤其是對身體虛弱的癌癥患者而言，使用化療藥物是具有一定危險(xiǎn)性的。維生素E琥珀酸酯是維生素E的一種衍生物，具有毒副作用小的效果，其發(fā)現(xiàn)提高了化療治療乳腺癌的用藥安全性。

本文設(shè)置了兩個對照，不加任何化學(xué)藥物的乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)基，和加了常用化療藥物絲裂霉素和環(huán)磷酰胺的細(xì)胞培養(yǎng)基。用于對比單獨(dú)用藥和聯(lián)合維生素E琥珀酸酯用藥的效果。結(jié)果表明:VES、MMC、CTX聯(lián)合使用能夠調(diào)控細(xì)比使用單一藥物相比對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用更明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。為何聯(lián)合用藥效果更好，猜想維生素E琥珀酸酯在抑制乳腺癌細(xì)胞的過程中與MMC、CTX產(chǎn)生了協(xié)同作用。已知Fas/FasL是癌細(xì)胞死亡的三大因子之一，在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋零的過程中起到了重要的作用。從流式細(xì)胞分析儀的分析結(jié)果來看，VES能夠調(diào)控Fas/FasL促使癌細(xì)胞凋亡，且VES聯(lián)合用藥后Fas的平均熒光強(qiáng)度和陽性率從4.09、92.5%提高到了22.0、100%；18.7、100%，F(xiàn)as表達(dá)增強(qiáng)。綜上，VES、MMC、CTX聯(lián)合使用能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞Fas的表達(dá)，抑制其生長。