覃 瑞 ，陳賢軍，湛 蔚，向妮艷，劉 虹，嚴(yán)興初，黃 穩(wěn)，覃爾岱，李 剛

(1.中南民族大學(xué) 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢 430062)

紅花(Carthamus tinctorius L.)是菊科紅花屬1 ～2 年生草本植物，又名草紅花，紅藍(lán)花，淮紅花，扎浪子(新疆維吾爾語)等.紅花在我國的種植有兩千多年的歷史，早在漢代就已有紅花種植的記載，紅花具有抗旱和抗寒能力，目前我國紅花的種植主要集中在新疆，云南，安徽，河南等地[1-2].紅花是一種油藥兩用的經(jīng)濟(jì)作物，其種子富含不飽和脂肪酸，特別是亞油酸含量很高，號稱“亞油酸之王”.同時，它也是一種傳統(tǒng)中藥材，具備降血壓，血脂，活血通經(jīng)，祛瘀止痛等效用[3].紅花是具有巨大遺傳潛力的花油兩用的經(jīng)濟(jì)作物，因?yàn)槿狈蚪M和轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，其遺傳潛力尚未完全挖掘，在20 世紀(jì)90 年代中期，紅花被國際植物遺傳資源研究所(IPGRI)和德國技術(shù)合作局(GTZ)認(rèn)定為25 種未被充分利用的作物之一[4].

DNA 分子標(biāo)記是評估群體內(nèi)或者群體間遺傳變異的可靠工具，簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)又稱微衛(wèi)星(microsatellites) 標(biāo)記是由幾個核苷酸(一般為1 ～6 個)為重復(fù)單位組成的長度為幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列. SSR 標(biāo)記擁有共顯性，高多態(tài)性，強(qiáng)穩(wěn)定性，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[5]，在很多的植物研究中被廣泛應(yīng)用，如水稻[6]，玉米[7]，小麥[8-9]，油菜[10]，棉花[11]，甜瓜[12]等.SSR 標(biāo)記的來源之一為快速增長的EST 序列[13]，EST-SSR 是基于轉(zhuǎn)錄組測序而非全基因組測序來開發(fā)的SSR 標(biāo)記，具有準(zhǔn)確，快速，廉價的優(yōu)點(diǎn).然而，目前在NCBI 上公布的有關(guān)紅花的DNA/RNA 序列少，不能滿足SSR 標(biāo)記的開發(fā).在本研究中，我們通過對云南紅花轉(zhuǎn)錄組的Illumina高通量測序和組裝，利用生物信息學(xué)軟件對得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中EST-SSR 的分布特征進(jìn)行了分析，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了紅花EST-SSR 標(biāo)記，并且初步驗(yàn)證了這些標(biāo)記在不同紅花品種中的可用性，為紅花EST-SSR 標(biāo)記的開發(fā)，核心種質(zhì)構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ).

1 材料方法

1.1 材料與DNA 提取

用于EST-SSR 引物可用性驗(yàn)證與多態(tài)性檢測的60 份紅花種質(zhì)材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供，材料信息見表1.按照改良的CTAB 法提取基因組DNA[14].提取的DNA 質(zhì)量通過1%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測.

1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的來源

用于轉(zhuǎn)錄組測序的紅花材料為云南紅花(YH)，種植于中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院溫室，待植株長到3 周左右，株高在10 cm 左右，取幼苗全株，立即置于液氮當(dāng)中，并將其保存在-80 ℃. 使用華越洋RNA提取試劑盒(HUAYUEYANG)并依據(jù)其流程進(jìn)行RNA 提取.將提取的RNA 送至安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司進(jìn)行Illumina 高通量測序，測序讀長為PE150.采用Trinity 軟件對經(jīng)過過濾的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接[15]，得到Unigene 序列.

1.3 EST-SSR 位點(diǎn)的篩選

利用MISA 軟件(http:/ /pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中識別出EST-SSR 位點(diǎn). 搜索參數(shù)設(shè)置為:重復(fù)基序?yàn)? ～6 bp，其中一、二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)序列的最小重復(fù)數(shù)分別為10、6、5、5、5 和5.

1.4 EST-SSR 引物設(shè)計與驗(yàn)證

基于默認(rèn)參數(shù)使用Primer 3.0 軟件設(shè)計EST-SSR引物，隨機(jī)選擇27 對引物驗(yàn)證EST-SSR 標(biāo)記(表2).PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序主要參照唐小慧等[5]的方法.PCR 產(chǎn)物檢測用4% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE).固定功率90 W，電泳90 分鐘，銀染顯色.

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)的數(shù)量與分布

經(jīng)過Trinity 拼接，云南紅花(YH)轉(zhuǎn)錄組共得到142 946 條Unigen 序列，總長為143.2Mb，N50 值為1 508bp，序列平均長度為1 002bp.用MISA 軟件對其進(jìn)行SSR 位點(diǎn)搜索，在其中的32 520 條Unigene 中檢測得到46 016 個EST-SSR 位點(diǎn).EST-SSR 發(fā)生概率(含有SSR 的Unigene 條數(shù)/總Unigene 條數(shù))為22.75%，分布頻率(SSR 個數(shù)/總Unigene 條數(shù))為32.19%，平均3.11kb 會出現(xiàn)一個EST-SSR 位點(diǎn).在32 520 條含有EST-SSR 位點(diǎn)的Unigene 序列中含2 個及2 個以上EST-SSR 位點(diǎn)的序列僅有9 533 條，其余序列只含有1 個EST-SSR 位點(diǎn).

2.2 紅花轉(zhuǎn)錄組中SSR 基序類型與頻率特征

在云南紅花(YH)轉(zhuǎn)錄組中，46 016 個EST-SSR位點(diǎn)一共包含425 種重復(fù)基序，單核苷酸重復(fù)不計算在其中. 其中二核苷酸重復(fù)數(shù)量最多，為17 319 個，占49.22%(圖1)；三核苷酸重復(fù)數(shù)量為16 299 個，占46. 32%；四核苷酸重復(fù)數(shù)量為1 040 個，占2.96%；五核苷酸重復(fù)數(shù)量為197 個，0.56%；六核苷酸重復(fù)數(shù)量為330 個，占0.94%. 在二核苷酸重復(fù)類型中，AG/CT 出現(xiàn)的頻率最高，達(dá)到44%(圖2)；AT/AT 占比為33%，AC/GT 占比為23%，CG/CG 占比為0.01%.在三核苷酸重復(fù)類型中，出現(xiàn)頻率最高的是AAG/CTT，達(dá)到24%(圖3)；ACC/GGT 占比為23%，ATC/ATG 占比為20%，AGG/CCT 占比為8%.

圖1 云南紅花轉(zhuǎn)錄組SSR 基序類型分布特征Fig.1 Distribution characteristics of SSR motif types in the transcriptome of YH safflower

圖2 云南紅花(YH)轉(zhuǎn)錄組二核苷酸SSR 基序分布特征Fig.2 Distribution of the dinucleotide SSR motifs in YH safflower transcriptome

圖3 云南紅花(YH)轉(zhuǎn)錄組三核苷酸SSR 基序分布特征Fig.3 Distribution of the trinucleotide SSR motifs in YH safflower transcriptome

2.3 紅花轉(zhuǎn)錄組中SSR 基序重復(fù)次數(shù)與長度分布

在云南紅花(YH)轉(zhuǎn)錄組中，SSR 重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)為5 ～34 次，此中5 次重復(fù)數(shù)最多，為9 369個，占26. 63% (圖4)；其次是六次為8 148 個，占23.16%；7 次有5 068 個，占14.40%；8 次為3 600個，占10. 23%；基序大于8 次的重復(fù)較少，共占25.58%.SSR 位點(diǎn)的長度以15 bp 最多，為8 388 個，占23.85% (圖5)；之后是18 bp，為6 181 個，占17.58%；12 bp 為3 681 個，占10.47%；14 bp 為2 890個，占8.22%；最長的SSR 位點(diǎn)為68 bp.

圖4 云南紅花(YH)轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)數(shù)重復(fù)次數(shù)分布Fig.4 Distribution of the SSR repeat numbers in YH safflower transcriptome

圖5 云南紅花(YH)轉(zhuǎn)錄組SSR 長度分布Fig.5 Distribution of the SSR repeat length in YH safflower transcriptome

2.4 紅花EST-SSR 引物有效性的初步驗(yàn)證

先將60 份不同來源紅花基因組DNA 進(jìn)行等量混融，以此為模板，對隨機(jī)選擇的27 對EST-SSR 引物(表2)進(jìn)行PAGE 檢測. 結(jié)果顯示27 對EST-SSR 引物中有21 對引物可以擴(kuò)增出清晰可讀且符合預(yù)期大小的條帶，有效擴(kuò)增率為77.8%，將21 對可以擴(kuò)增出預(yù)期大小條帶的EST-SSR 引物在60 份不同來源的紅花品種中進(jìn)行多態(tài)性檢測分析. 擴(kuò)增結(jié)果表明12 對引物多態(tài)性理想(表2 中黑體字部分).多態(tài)性引物比率為44. 4%. 其中HHSSR-5，HHSSR-10，HHSSR-16的擴(kuò)增效果如圖6.

表2 27 對EST-SSR 引物信息Table 2 Information of 27 pairs of EST-SSR primers

注:表中加粗的部分為多態(tài)性理想的SSR 引物Note: The primers in bold are polymorphic primers

圖6 3 對EST-SSR 引物在60 份紅花DNA 模板中的擴(kuò)增效果Fig.6 Amplification using three EST-SSR primers in sixtysafflower DNA samples

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測序并不依賴于物種的全基因組信息，便能獲取全部轉(zhuǎn)錄本信息[16]. 現(xiàn)如今許多植物的轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)完成，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR 標(biāo)記已經(jīng)越來越多的被應(yīng)用到茶樹[17]，芝麻[18]，豌豆[19]等植物研究中.

本研究是基于紅花轉(zhuǎn)錄組開展的SSR 位點(diǎn)分析和標(biāo)記挖掘，云南紅花(YH)轉(zhuǎn)錄組中，在142 946 條轉(zhuǎn)錄本序列中篩選出46 016 個SSR 位點(diǎn)，涉及32 520條Unigene 序列，分布頻率為每3.11kb 一個SSR 位點(diǎn). 紅花轉(zhuǎn)錄組 SSR 分布頻率高于紅松的17.38 kb[20]，木豆的8.4 kb[21]，杏仁樹的5.45 kb[22]，柑橘的5.20 kb[23].這表明紅花轉(zhuǎn)錄組SSR 數(shù)量上更加豐富. 紅花SSR 分布頻率與楠木(1/3. 37 kb)相近[16]，低于橡膠(1/0.92 kb)[24].由于物種的基因組大小，搜索軟件及其參數(shù)設(shè)定等多種因素可以導(dǎo)致SSR 分布頻率的差異. 在本研究中，轉(zhuǎn)錄組測序采用的材料是幼苗全株，測序質(zhì)量好，構(gòu)建的文庫質(zhì)量高，測序獲得的EST 序列平均長度較長，說明cDNA 文庫的構(gòu)建可能影響SSR 分布頻率.

根據(jù)已有的報告，多數(shù)植物SSR 標(biāo)記的重復(fù)類型主要為二，三核苷酸重復(fù)，這兩種類型的核苷酸重復(fù)的多態(tài)性普遍高于其他基序重復(fù)類型.如茶樹[17]，橡膠樹[25]等以二核苷酸重復(fù)基序?yàn)樽疃?，而黃麻[26]，紫楠[27]，芝麻[18]，番薯[28]等以三核苷酸重復(fù)基序?yàn)樽疃?本研究發(fā)現(xiàn)，在云南紅花(YH)轉(zhuǎn)錄組中數(shù)量最多的基序重復(fù)類型為二核苷酸(17 319 個)稍多余三核苷酸(16 299 個). AG/CT 為二核苷酸中的優(yōu)勢重復(fù)基序，AAG/CTT 為三核苷酸中的優(yōu)勢重復(fù)基序，這結(jié)果符合在雙子葉植物中AAG/CTT 為其優(yōu)勢重復(fù)基序的規(guī)律[29].

另外，隨機(jī)選取27 對設(shè)計的EST-SSR 引物合成并初步驗(yàn)證，21 對引物在60 份不同來源的紅花DNA中均能擴(kuò)增出清晰可讀且符合預(yù)期大小的條帶，其中12 對引物的多態(tài)性理想，多態(tài)性引物比率為44.4%，高于菠菜[30]和南方紅豆杉[31]. 該結(jié)果表明開發(fā)的EST-SSR 引物可以用于紅花遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系研究，同時表明基于紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR 標(biāo)記是可以實(shí)施的.在不同物種中基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR 標(biāo)記的成功率存在差異，這可能與不同物種的DNA 轉(zhuǎn)錄序列的保守性有關(guān)[26].

本研究基于紅花轉(zhuǎn)錄組的高通量測序數(shù)據(jù)，從總RNA 水平上有針對性地進(jìn)行了紅花特異性SSR 位點(diǎn)的檢索和評價，結(jié)果表明紅花轉(zhuǎn)錄組SSR 發(fā)生率較高，類型豐富，實(shí)用性較高. 我們開發(fā)了大量的ESTSSR 標(biāo)記，這些標(biāo)記具有極高的實(shí)際應(yīng)用價值，因?yàn)樗亩鄳B(tài)性可能直接具有相關(guān)基因的功能，并可以在近緣物種中使用. 結(jié)合轉(zhuǎn)錄組功能注釋分析，可以找出與功能基因相關(guān)聯(lián)的EST-SSR 標(biāo)記，如具有與產(chǎn)量性狀相關(guān)的開花基因，具有重要經(jīng)濟(jì)價值的黃酮代謝途徑有關(guān)的基因等，這將為紅花優(yōu)良性狀的研究提供幫助.同時EST-SSR 標(biāo)記也為紅花的遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)資源表征和分子標(biāo)記輔助育種等提供了有力工具.