劉 虹，黃 文，劉秋宇，蘭德慶，易麗莎，覃 瑞

(中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

目前金腰屬在全世界范圍約有90 種(The Plant List)，亞、歐、非、美四洲均有分布，但主要分布于亞洲溫帶.生于海拔450 ～4 800 米的林下、高山灌叢、高山草甸和高生碎石隙.我國(guó)約40 種，南北均有分布[1-5].Franchet 依據(jù)葉子的對(duì)生與互生葉的存在為依據(jù)，將該屬分為Sect. Oppositifolia 和Sect. Alternifolia 兩組[6]；在此基礎(chǔ)上，1957 年Hara 根據(jù)莖、葉及萼片等形態(tài)特征將金腰屬分為了17 個(gè)系[7]. 潘錦堂也將金腰屬分為金腰亞屬(Subgen. Chrysosplenium)和互葉亞屬(Subgen. Gamosplenium Maxim.)兩大亞屬[8]，但作為分類學(xué)上最困難的群體之一，目前本屬內(nèi)的分類還存在較大問(wèn)題，需要輔以分子手段來(lái)解決.

Nakazawa 和Soltis 使用葉綠體matK 基因?qū)鹧鼘僦参镞M(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育研究，他們發(fā)現(xiàn)分子數(shù)據(jù)與Hara 提出的以前的分類基本一致.然而，其涉及的金腰種類偏少，覆蓋面不全[9-10].Kim 等人利用ITS 序列對(duì)韓國(guó)金腰屬的毛金腰系植物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果證實(shí)ITS 序列能有效地將毛金腰系中不同的變種區(qū)分開(kāi)，但對(duì)不同居群的同一種幾乎沒(méi)有分辨率[2，11].Han 等人也利用ITS 序列結(jié)合種皮形態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育重建，結(jié)果證明ITS 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與種皮形態(tài)分類結(jié)果一致，說(shuō)明利用ITS 序列對(duì)金腰屬植物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究是有效的[12]. Li 等人也通過(guò)對(duì)6286 份材料進(jìn)行ITS 序列特征分析，發(fā)現(xiàn)ITS 序列適用于虎耳草科的研究[13].

目前，利用分子系統(tǒng)發(fā)育的方法雖然仍有很多因素影響會(huì)物種鑒定，但是生物系統(tǒng)發(fā)生的進(jìn)化歷程在一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)上都會(huì)保留進(jìn)化痕跡，并且高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能有更加密切的聯(lián)系，這一層面上的二級(jí)結(jié)構(gòu)更能直觀地揭示物種進(jìn)化史[14]. 已有研究認(rèn)為利用ITS 的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的誤差進(jìn)行更加精確的修正重構(gòu)是可行有效的，特別是在核苷酸序列突變頻率較大，但二級(jí)結(jié)構(gòu)卻很保守的真核生物核糖體ITS2 序列上[15-16]. 在許多以二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析為工具來(lái)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化的研究中，RNA 的折疊結(jié)構(gòu)常用來(lái)改善多序列的比對(duì)，雖然序列比對(duì)的結(jié)果還不能完全正確，但這種方法確實(shí)能夠提高序列比對(duì)的準(zhǔn)確性，加強(qiáng)系統(tǒng)發(fā)育的重建[17]. 當(dāng)前在與ITS 二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)的研究中，補(bǔ)償性堿基配對(duì)變化(compensatory base pair changes， CBCs)開(kāi)始越來(lái)越多地應(yīng)用到種間和種內(nèi)關(guān)系的研究中[18-19].由于rRNA 的多個(gè)拷貝之間有協(xié)同進(jìn)化的趨勢(shì)，因此CBCs 可作為兩個(gè)居群之間沒(méi)有發(fā)生基因交換的重要指標(biāo). 這個(gè)假設(shè)被稱為CBC criterion，此后Muller 等人用使用了30 萬(wàn)個(gè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)此假設(shè)進(jìn)行了驗(yàn)證，通過(guò)綜合分析后他們得出了兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)論，如果兩個(gè)個(gè)體之間存在CBC，那么它們是兩個(gè)不同的種的概率約為93%；當(dāng)兩個(gè)個(gè)體之間不存在CBC，那么它們是同一種的概率約為76%[20].本研究旨在通過(guò)分析核糖核酸內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的DNA 序列，以解決金腰屬中兩大亞屬的分類問(wèn)題.

1 材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料共選取金腰21 種，其中8 種來(lái)自NCBI，包含的外類群金腰的近緣屬澗邊草屬的澗邊草(Peltoboykinia tellimoides)，其它13 種由實(shí)驗(yàn)室取自武陵山區(qū)，實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源見(jiàn)表1.

1.1 金腰基因組DNA 的提取

金腰干燥的樣品各取15 mg，在液氮中研磨成粉.采用改良的CTAB 法提取各樣品的總DNA[21]. 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度，再用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)質(zhì)量，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

表1 實(shí)驗(yàn)材料基本信息Table 1 Information of the experimental materials

1.2 PCR 擴(kuò)增測(cè)序與數(shù)據(jù)處理

選取在系統(tǒng)發(fā)育中被廣泛應(yīng)用的ITS 序列擴(kuò)增，引物序列為:

PCR 擴(kuò)增體系參考Kim 等人[11]，將樣品送至北京華大科技有限公司測(cè)序.所得序列用Mega6.0 軟件進(jìn)行剪接與校隊(duì)[22]，并進(jìn)行Clustal W 多序列比對(duì)，分析堿基組成，GC 含量，計(jì)算遺傳距離(K2P)，并用ML 法(Maximum Likelihood)構(gòu)建最大似然樹(shù)，所有樹(shù)均以1000 次bootstrap 檢驗(yàn)樹(shù)分支支持率. 再用Mrbayes 軟件構(gòu)建貝葉斯(Bayes)樹(shù)[23-24].ITS2 核心二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)采用ITS2 database[25-26]. CBCs 統(tǒng)計(jì)分析使用軟件4SALE[27].

2 結(jié)果與分析

2.1 金腰屬ITS 序列特征

分析結(jié)果顯示ITS 序列總長(zhǎng)為643 ～653 bp，檢測(cè)到保守位點(diǎn)392 個(gè)、變異位點(diǎn)273 個(gè)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)176 個(gè).與ITS1 和ITS2 相比，5.8S 的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)都極少，顯示出這一區(qū)域在長(zhǎng)度和堿基變化上都非常穩(wěn)定，多數(shù)集中在ITS1 和ITS2 區(qū)域.從表2可看出，在對(duì)生葉的種間比較，其ITS1 的GC 含量比ITS2 高，在互生葉的種間比較正好相反，ITS2 的GC含量比ITS1 高，而在對(duì)葉亞屬與互葉亞屬間比較，對(duì)生葉ITS1 的GC 含量比互生葉高，在ITS2 序列中相反，互生葉的GC 含量比對(duì)生葉高.在對(duì)生葉的種中，中華金腰C. sinicum 和山溪金腰C. nepalense 這兩個(gè)種的GC 含量偏高，特別是在ITS2 序列中，其GC 含量明顯高于其它對(duì)生葉的種和平均值，并且在之后的系統(tǒng)分類中，這兩個(gè)種的分類位置也較特殊.

從表3 可看出除了中華金腰C. sinicum 和山溪金腰C. nepalensel 這兩個(gè)種以外，互生葉種之間的種間遺傳距離和對(duì)生葉種之間的種間遺傳距離比互生葉種和對(duì)生葉種之間的遺傳距離要小.而C. sinicum和C. nepalense 這兩個(gè)種表現(xiàn)出來(lái)的特征卻正好相反，它們都屬于對(duì)葉亞屬，但與互生葉種的種間遺傳距離較小，與對(duì)生葉種的種間遺傳距離卻較大.

表2 金腰屬對(duì)葉亞屬與互葉亞屬的ITS 序列長(zhǎng)度(bp)與GC 含量(%)Table 2 The length(bp) and GC content(%) of Chrysosplenium ITS sequence

表3 金腰屬種間遺傳距離Table 3 Genetic distance among species of Chrysosplenium

2.2 金腰屬系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ML 法和Bayes 法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，將它們的聚類情況結(jié)合形態(tài)分類學(xué)互相比較分析，如圖1和圖2 結(jié)果顯示ML 樹(shù)與Bayes 樹(shù)的聚類結(jié)果都能將互葉亞屬與對(duì)葉亞屬區(qū)別開(kāi)并聚類在一個(gè)較大分支中，共同將C. sinicum 和C. nepalense 這兩個(gè)對(duì)生葉的種被一起聚類到互葉亞屬和對(duì)葉亞屬并列的另一分支中，結(jié)合這個(gè)兩個(gè)種的GC 含量明顯高于其它種且遺傳距離也與其它種較遠(yuǎn)的情況，這個(gè)分類結(jié)果可能說(shuō)明這兩個(gè)種比其它種更為原始或者其進(jìn)化速率更緩慢，它們的ITS 序列更為保守，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定.但在節(jié)點(diǎn)給出的置信度上，Bayes 樹(shù)普遍比ML 樹(shù)高，如C.delavayi 1 與C. delavayi 2 這兩個(gè)種的小分支節(jié)點(diǎn)ML樹(shù)置信度為70%，Bayes 樹(shù)為89%；C. flaviflorum、 C.pilosum 1 和C. pilosum2 三個(gè)種組成的分支的節(jié)點(diǎn)置信度在ML 樹(shù)上為68%，Bayes 樹(shù)為97%.Bayes 法給出進(jìn)化樹(shù)與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果較為接近，其置信度和種間的分辨率也較高.

圖1 基于最大似然法ML 對(duì)金腰屬種構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Maximum Likelihood tree of Chrysosplenium

圖2 基于Bayes 法對(duì)金腰屬種構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Bayes tree of Chrysosplenium

2.3 ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)和CBCs 分析

在圖3 中，ITS2 database 的motif 檢測(cè)結(jié)果顯示出三個(gè)模體的存在(Motif I-III).Motif 顯示在灰色區(qū)域，綠色背景為保守區(qū)域，從圖中可看出這兩種區(qū)域幾乎都分布在HII 和HIII 中，這種分布可能對(duì)其形成這兩個(gè)螺旋臂有重要作用，特別是對(duì)真核生物ITS2 的二級(jí)核心結(jié)構(gòu)的形成提供保障，尤其在HII 臂中，Motif I和II 幾乎覆蓋了大部分結(jié)構(gòu)以及它周圍的位點(diǎn).位于HIII 的T3 發(fā)卡環(huán)在所有樣本中分為兩種結(jié)構(gòu)T3a 和T3b，是由C.pi 2、C.pi 1、C.glo 1、C.glo 2 三個(gè)種在圖中159 位點(diǎn)處發(fā)生U-C 堿基替換而形成大小不同的發(fā)卡環(huán).同時(shí)在其它螺旋臂上也存在一些較保守的變異位點(diǎn)，這些變異位點(diǎn)都只在個(gè)別的種里發(fā)生了變化，如圖中第40、160、164 位點(diǎn)處，雖然這些位點(diǎn)改變，但對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)未造成影響，雖然目前它僅在少數(shù)種中發(fā)生變化，但筆者推測(cè)在之后的進(jìn)化過(guò)程中，此類位點(diǎn)可以被允許較頻繁的發(fā)生變異. 此外，位于第54、123 的位點(diǎn)變化也表現(xiàn)出在互葉亞屬和對(duì)葉亞屬中組內(nèi)一致，組間不同的特征，第54 位點(diǎn)在對(duì)葉亞屬中為G 堿基，互葉亞屬中為U 堿基；第123 位點(diǎn)在對(duì)葉亞屬中為A 堿基，互生葉為G.此外，澗邊草的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)位于圖3 左上方，其整體結(jié)構(gòu)與金腰屬幾乎沒(méi)有差異.

圖3 ITS2 一致性結(jié)構(gòu)分析圖Fig.3 The predicted consensus secondary structure of the ITS2

在ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)中CBCs 配對(duì)(圖3 中黑框堿基對(duì))分布在HII、HIII、HIV 臂中，共有4 對(duì).在表6 中，列出了金腰屬21 個(gè)種和變種兩兩對(duì)應(yīng)的CBCs 數(shù)量，從中 可 看出 C. pilosum var. sphaerospermum、 C.valdepilosum、C. pilosum 1、C. pilosum 2 、C. flaviflorum

這5 個(gè)種和其余至少15 個(gè)種都有CBCs，表4 顯示了在互葉亞屬內(nèi)的種間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CBCs，與之不同的是，對(duì)葉亞屬內(nèi)(表5)的種都存在與其它幾個(gè)種有CBCs的情況，但在原變種與變種之間未發(fā)現(xiàn)CBCs. 此外，C. sinicum、C. nepalense 這兩個(gè)種互相之間未發(fā)現(xiàn)CBCs 存在，但它們與其余對(duì)生葉種之間都有CBCs 存在，而它們?cè)诨ト~組中，除了C. davidianum，與其余種都沒(méi)有CBCs 發(fā)現(xiàn)(表4-6).

表4 金腰屬互葉亞屬ITS2 CBCsTable 4 ITS2 CBCs in Alternifolia of Chrysosplenium

表5 金腰屬對(duì)葉亞屬ITS2 CBCsTable 5 ITS2 CBCs in Oppositifolia of Chrysosplenium

C. flavi florum 1 3 1 0 2 0 3 1 0 0 1 C. pilo sum 1 1 2 0 0 2 0 2 1 0 0 1 C. nepa lense 2 0 2 3 2 3 2 2 3 2 2 C. qinlin gense 0 2 1 1 0 1 1 2 1 0 0 C. pilo sum 2 1 3 0 0 1 0 0 3 1 0 1 C. cava leriei 0 2 0 0 0 0 0 2 0 0 0 C. dela vayi 2 0 2 1 1 0 1 1 2 0 1 0

表6 金腰屬ITS2CBCs 比較Table 6 ITS2 CBCs in Chrysosplenium

3 討論

本文結(jié)果表明，對(duì)生葉的中華金腰C. sinicum 和山溪金腰C. nepalensel 兩個(gè)種的特征與其它對(duì)生葉種和互生葉種之間的整體差異不符.如:(1)其它對(duì)生葉種ITS2 中的GC 含量是明顯低于互葉亞屬的，而它們的GC 含量甚至比互生葉的種都要高.它們?cè)谡麄€(gè)ITS 區(qū)域的GC 含量也明顯高于其它19 個(gè)種. (2)在金腰屬種間遺傳距離的分析中，我們發(fā)現(xiàn)互生葉種內(nèi)之間的種間遺傳距離和對(duì)生葉種內(nèi)之間的種間遺傳距離較小，而互葉亞屬和對(duì)葉亞屬之間的遺傳距離較高.但C. sinicum 和C. nepalense 雖然是對(duì)生葉植物，但與此特征正好相反，它們與互生葉的遺傳距離更小.

在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的聚類分析中，這兩個(gè)種并未被歸于互生葉或?qū)ι~的分支中，而是單獨(dú)被歸于另一與對(duì)生、互生分支并列的分支上.在ITS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析上，我們也標(biāo)注出了這兩個(gè)種與其它種都不相同的堿基配對(duì)位點(diǎn)，在l3 環(huán)上我們還發(fā)現(xiàn)了只有這兩個(gè)種存在堿基插入情況，也或者是其它種在這個(gè)位置堿基的集體缺失.在CBCs 的分析中，我們?cè)贗TS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)中它們與對(duì)生葉種中都有CBCs，與多數(shù)互生葉種卻沒(méi)有，而其它對(duì)生葉的種都或多或少與幾個(gè)互生葉種存在CBCs.

因此，C. sinicum 和C. nepalense 這兩個(gè)種可能是金腰屬種最原始的物種，它們?cè)谛螒B(tài)學(xué)與對(duì)葉亞屬相符，但分子序列的特征上卻與互葉亞屬更相近. 筆者推測(cè)，C. sinicum 和C. nepalense 在進(jìn)化上可能處于更靠近金腰屬基部的位置，因此，C. sinicum 和C. nepalense 這兩個(gè)種可能為金腰屬中的原始種，而后分化產(chǎn)生了互生亞屬和對(duì)葉亞屬.

除了中華金腰C. sinicum 和山溪金腰C. nepalensel 這兩個(gè)種之外，在本實(shí)驗(yàn)中，互葉亞屬和對(duì)葉亞屬在分子水平的多個(gè)方面表現(xiàn)出穩(wěn)定的差異，這兩個(gè)組之間從ITS 序列特征、種間遺傳距離和二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息上都能被區(qū)別出來(lái)，如兩組在序列上存在一些較特殊的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的堿基在兩組間不同，在兩組內(nèi)一致，其中最明顯的是在5.8S 上的一個(gè)位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)的差異形成了兩組間5.8S 二級(jí)結(jié)構(gòu)最大差異結(jié)構(gòu)，由于5.8S 的二級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的合成相關(guān)聯(lián)，兩組間這種結(jié)構(gòu)的差異可能與其功能有關(guān). 通過(guò)對(duì)CBCs 的分析，我們判斷對(duì)生亞屬之間發(fā)生雜交的情況和可能性遠(yuǎn)比互生亞屬要少，對(duì)生亞屬似乎更趨向于各自獨(dú)立進(jìn)化，互生亞屬可能更容易互相雜交產(chǎn)生變種甚至是新種. 從金腰屬ITS 序列提供的信息來(lái)看，對(duì)生亞屬之間的差異明顯要比互生亞屬之間的差異要大，這可能也說(shuō)明對(duì)生亞屬由于各自獨(dú)立進(jìn)化，其DNA 的差異也呈增大的趨勢(shì)，而互生亞屬之間由于雜交的可能性高，它們的DNA 能互相融合減小差異或者緩解差異增大的可能性也更大.這可能揭示了金腰屬植物葉對(duì)生和互生這兩種類型的種的進(jìn)化方式存在差異，隨著時(shí)間推移它們的差異可能會(huì)越來(lái)越明顯最終表現(xiàn)出完全不同的進(jìn)化方式，而這種不同的進(jìn)化方式會(huì)導(dǎo)致它們的后代差異越來(lái)越大甚至可能分化形成不同的屬.