達(dá)娃卓瑪，羅華秀，旺杰次仁，巴桑卓嘎，王曉玲

(1.西藏自治區(qū)食品藥品檢驗研究院，西藏 拉薩850000；2.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都610041)

藏藥千里光膏飲片為采自西藏地區(qū)的菊科千里光屬植物川西千里光(Senecio solidagineus Hand. -Mazz.)水提取濃縮的干浸膏.制備方法是將風(fēng)選干凈的川西千里光藥材打粉，加入鍋中，加適量的水，進(jìn)行煎煮后取上清液，藥渣再加適量水煎煮后取出上清液，通過三次的煎煮取上清液后，去除藥渣，而后將上清液進(jìn)行濃縮熬制成干浸膏飲片.《中國植物志》以及《藏藥志》中記載該植物具有清熱、解毒、治瘡、接骨等功效，全草入藥可用于治療跌打損傷、傷口化膿、腫脹疼痛、急性結(jié)膜炎、皮炎、瘡癤等癥狀[1-2]. 藏藥千里光膏飲片在西藏地區(qū)主要用于愈合創(chuàng)傷、清熱解毒、清肝膽諸熱等癥狀.

川西千里光成分研究方面比較全面，文獻(xiàn)報道，該植物含有黃酮、生物堿、有機(jī)酸、倍半萜類成分[3-4].本課題組研究發(fā)現(xiàn)千里光膏飲片中富含綠原酸，而且是膏體中的主要成分. 大量研究表明該成分具有對自由基的清除及抗脂質(zhì)過氧化作用[5-7]、抗腫瘤作用[8]、保肝利膽作用[9]、抑菌[10-11]等多種活性.為了快速有效地鑒定千里光膏飲片中綠原酸成分以及測定其含量，本實(shí)驗采用TLC 法對飲片中綠原酸進(jìn)行定性鑒別，采用SPE 技術(shù)富集樣品溶液中的綠原酸，HPLC 法測定其在千里光膏飲片中的含量.SPE 技術(shù)作為樣品前處理技術(shù)，已成熟用于萃取、濃縮和凈化液體樣品中的半揮發(fā)性和不揮發(fā)性化合物[12-15]，且凈化效果好，回收率高. 對該民族藥化學(xué)成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的研究，有利于闡明該民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為全面評價和控制該藥質(zhì)量提供參考.

1 儀器與材料

1.1 儀器

久品中藥粉碎機(jī)(JP -500C -8 型，永康市久品工貿(mào)有限公司)；電子天平(BSA124S-CW 型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；去離子超純水機(jī)(HT-RO-60L/H 型，上海濱特環(huán)?？萍加邢薰?；雙列四孔水浴鍋(DK -S24 型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV8V-C 型，上海言合儀器科技有限公司)；超聲波清洗機(jī)(JP -040S 型，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；移液槍(500 -5000 μL，Sartorius)；微量點(diǎn)樣針(上海高鴿工貿(mào)有限公司)；紫外燈分析儀(ZF-I 型，上海顧村電光儀器廠)；Waters 2695/2996 高效液相色譜儀.

1.2 材料

對照品綠原酸(批號:PS000627)購于成都普斯生物科技有限公司，經(jīng)面積歸一化法測定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.84 %.供試品千里光膏飲片收購于西藏3 個廠家(批號分別 為:160401、160402、160403、16062301、16062302、16062303、Y -16062801、Y -16062802、Y-16062803、Y-16062804).甲醇、乙腈(色譜純)、超純水、其余試劑純度均為國產(chǎn)分析純，硅膠薄層板GF254(青島海洋化工有限公司)，Waters SunFireTM C18 色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；SPE 柱(Waters Sep - Pak ? Vac 20 CC (5g) C18 Cartridges)；0.45 μm 微孔濾膜(上海泰坦科技公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸的TLC 鑒別

將千里光膏飲片固體樣品打成粉末并過2 號篩，放置于烘箱中45 ℃烘2 h 后，放至室溫.快速并精密稱取1.0 g 樣品粉末，置具塞錐形瓶中.精密量取新鮮配制的70 %甲醇20 mL，加入樣品中，常溫超聲處理15 min，放置室溫后，搖勻并過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液.另精密稱取綠原酸對照品5.0 mg 于10 mL容量瓶中，加入新鮮配制的70 %甲醇制成每l mL 含0.5 mg 的溶液作為對照品溶液. 綠原酸的TLC 鑒別照薄層色譜法(《中國藥典》2015 年版四部通則0502)試驗[16]，微量點(diǎn)樣針分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各1 μL，點(diǎn)于同一硅膠薄層板(GF254)上，以乙酸丁酯-丙酮-甲酸-水(5:4:1:1)為展開劑，飽和10 min，然后展開8 cm，取出，熱風(fēng)吹干，置紫外燈(365 nm)下檢視.薄層色譜中，樣品與對照品對應(yīng)的位置處顯相同的亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，各批次之間差別不大(圖1).

圖1 10 批樣品和對照品TLC 圖1 -10:樣品批號160401、160402、160403、16062301、16062302、16062303、Y-16062801、Y-16062802、Y-16062803、Y-16062804；11:綠原酸對照品Fig.1 TLC chromatogram of 10 batches of samples and reference substance

2.2 綠原酸含量測定

2.2.1 色譜條件

采用Waters SunFireTMC18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)色譜柱，流動相為乙腈-0.1 %甲酸水溶液(19:81)，體積流速為1.0 mL·min-1，檢測波長327 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于5 000.在上述色譜條件下，得出對照品及10 批千里光膏飲片供試品的色譜圖(圖2).

圖2 對照品和10 批樣品含量測定HPLC 圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of reference substance and 10 batches of samples

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取10.0 mg 綠原酸放入50 mL 容量瓶中，用10 % 甲醇定容到刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1，溶液用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液作為對照品溶液.

2.2.3 供試品溶液的制備

將千里光膏飲片固體樣品打成粉末并過2 號篩，放置于烘箱中45 ℃烘2 h 后，關(guān)閉溫度放至室溫.快速并精密稱取1.0 g 樣品粉末，放置于具塞錐形瓶中.精密量取新鮮配制的10 %甲醇20 mL，加入樣品中，常溫超聲處理15 min(500 W，40 kHz)，放置室溫，過濾，濾液用10 %甲醇定容至25 mL，搖勻，精密吸取3 mL 溶液過SPE 柱，用10 %甲醇溶液沖柱，收集最先餾出的30 mL 餾出液，旋蒸儀45 ℃抽真空旋干，殘留物用10 %甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，溶液用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液.

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液2、4、6、8、10 mL，置5 個10 mL 容量瓶中，用10 %甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mg·mL-1. 溶液用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液作為樣品溶液.按“2.2.1”項下液相色譜條件進(jìn)樣，測定綠原酸色譜峰峰面積. 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得出綠原酸的線性回歸方程為y ＝3E ＋07x – 145761(R2＝0.9991)，線性范圍為0.04 ～0.2 mg·mL-1.

2.2.5 精密度試驗

試驗樣品溶液為上述“2.2.2”項下對照品溶液，按“2.2.1”項下液相色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄每次的綠原酸色譜峰峰面積，計算得出綠原酸峰面積的RSD 值為0.66 %，表明該試驗儀器精密度良好.

2.2.6 重復(fù)性試驗

按“2.2.3”項下千里光膏飲片供試品溶液的制備方法，精密稱取同一批次千里光膏飲片樣品粉末6份，按“2.2.3”項下千里光膏飲片供試品溶液的制備方法平行制備樣品溶液，按“2.2.1”項下液相色譜條件進(jìn)樣，記錄綠原酸色譜峰峰面積，得出綠原酸RSD值為1.63 %，表明該試驗重復(fù)性良好.

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

按“2.2.3”項下千里光膏飲片供試品溶液的制備方法，精密稱取同一批次千里光膏飲片樣品粉末制備樣品溶液，按“2.2.1”項下液相色譜條件進(jìn)樣，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄綠原酸色譜峰峰面積，得出綠原酸RSD 為1.06 %，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)不變質(zhì)，穩(wěn)定性良好.

2.2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知綠原酸含量的同一批次千里光膏飲片樣品粉末6 份，每份1. 0 g，分別精密加入“2.2.2”項下質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的綠原酸對照品溶液2 mL，按“2.2.3”項下千里光膏飲片供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，按“2.2.1”項下液相色譜條件進(jìn)樣，計算加樣回收率，得出綠原酸平均回收率為107.40 %，RSD 為2.45 %.

2.2.9 定性限及定量限

按“2.2.1”項下液相色譜條件進(jìn)樣一針空白，得出和綠原酸保留時間一致處的基線噪音值.精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液，用10 %甲醇逐級稀釋至信噪比S/N ≈10，得出綠原酸的定量限為0.0113 mg·mL-1，S/N ≈3 時，得出綠原酸的檢測限為0.0072 mg·mL-1.

2.2.10 樣品測定

分別稱取10 批千里光膏飲片樣品粉末1.0 g，按“2.2.3”項下千里光膏飲片供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，每批樣品平行制備樣品3 份，按“2.2.1”項下液相色譜條件進(jìn)樣，得到綠原酸的峰面積值，代入“2.2.4”項下回歸方程計算每批千里光膏飲片中綠原酸的含量(表1).

表1 千里光膏飲片中綠原酸測定結(jié)果(n ＝3)Table1 Determination of chlorogenic acid in Senecio solidagineus Hand. -Mazz. extracts (n ＝3)

3 討論

3.1 樣品溶液提取方法和色譜條件的優(yōu)化

分別考察了用不同比例甲醇作為提取溶劑的提取效果，確定10 %甲醇作為提取溶劑提取效果最優(yōu).通過對常溫超聲、80 ℃水浴回流2 種提取方法進(jìn)行考察，確定采用10 %甲醇常溫超聲提取效果最佳.在提取時間的選擇上，對超聲時間10、15、20、25、30 min進(jìn)行考察，HPLC 結(jié)果顯示超聲時間為15 min 時，綠原酸百分含量最高，表明綠原酸已提取完全，且隨著超聲時間的延長，對提取結(jié)果并無顯著影響，所以最終確定樣品溶液提取方式為10 %甲醇常溫超聲處理15 min.在選擇流動性時，甲醇-水系統(tǒng)與乙腈-水系統(tǒng)相比較，發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)呈現(xiàn)更好的分離度，較短的分析時間以及較低的柱壓，0.1 %甲酸水溶液與0.5 %磷酸水溶液相比較，0.1 %甲酸水溶液在優(yōu)化峰型方面較0.5 %磷酸水溶液效果好，所以最終確定HPLC 試驗流動性為乙腈-0.1 %甲酸水溶液.

3.2 樣品提取液的純化方法考察

綠原酸是一類極性較大的成分，而且是千里光膏飲片中的主要成分，但是浸膏中極性相對綠原酸較小的成分較多，且含量少. 本課題組考察了樣品提取液經(jīng)SPE 柱純化和未經(jīng)過SPE 柱純化兩種處理方法，由兩組試驗結(jié)果得出，提取液經(jīng)SPE 柱純化處理后，圖譜采集時間縮短至10 min，實(shí)現(xiàn)了對分析物綠原酸的富集，有效縮短了HPLC 的圖譜采集時間，且重現(xiàn)性好，回收率高，故選擇SPE 對提取液做純化處理.

4 小結(jié)

本試驗首次建立了測定藏藥千里光膏飲片中綠原酸的TLC 法和HPLC 法，該方法快捷方便、準(zhǔn)確可靠，為全面評估千里光膏飲片質(zhì)量提供了一定的參考.試驗中使用了SPE 柱對樣品中綠原酸等極性相對較大成分進(jìn)行富集處理，并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)考察.該方法具有簡便快捷、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性、穩(wěn)定性較好等特點(diǎn).實(shí)驗得出10 批千里光膏飲片產(chǎn)品中的綠原酸百分含量在1.59 % ～3.07 %之間，因此建議千里光膏飲片中的綠原酸含量不得低于1.0 %.