王 偉，尤翠萍

(1.臨沂市食品藥品檢驗檢測中心， 山東 臨沂 276000； 2.臨沂市人民醫(yī)院， 山東 臨沂 276000)

蜂王漿是眾多蜂產(chǎn)品中的一種，含有12種以上蛋白質(zhì)、26種以上氨基酸、10多種維生素，其中B族維生素含量特別豐富，相較于其他蜂產(chǎn)品，蜂王漿中的10-羥基-癸烯酸(10-HDA)是其所特有的活性物質(zhì)。其性平，味甘、酸，入脾、肝、腎經(jīng)，為中國傳統(tǒng)補(bǔ)益用藥。蜂王漿營養(yǎng)價值高無毒副作用，能夠提高免疫力，抗氧化、抗菌消炎等[1-5]。蜜蜂養(yǎng)殖中，為了防治疾病，抗生素經(jīng)常被用到?；前奉愃幬锸菑V譜抑菌藥，對細(xì)菌性病害效果較好，價格較低，在蜜蜂養(yǎng)殖中常用于防治疾病，增加蜂蜜產(chǎn)量[6-7]?，F(xiàn)國家標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)明確規(guī)定磺胺類藥物的殘留限量，如在養(yǎng)殖中濫用，且不遵守休藥期規(guī)定，會導(dǎo)致蜂產(chǎn)品如蜂蜜、蜂王漿中磺胺類藥物殘留超過限量，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量。

目前蜂產(chǎn)品中磺胺類藥物的主要檢測方法為高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[8-10]，其中蜂王漿中磺胺類藥物殘留最常見的檢測方法為高效液相色譜法[11-13]。高效液相法中前處理過程復(fù)雜，甚至還需要衍生化，且儀器檢測所需時間較長，只能通過光譜和出峰時間來判斷，液質(zhì)串聯(lián)法在定量、定性檢測中更為準(zhǔn)確，且一次性能夠檢測組分較為復(fù)雜的化合物，逐漸成為一種更好的檢測方法。本文中建立了同時能夠檢測7種磺胺類藥物的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，前處理簡單，相較于其他液質(zhì)串聯(lián)法所需時間更短，前處理方法上也進(jìn)行了優(yōu)化，適用于蜂王漿中磺胺類藥物的快速篩查。

1 材料與方法

1．1 主要儀器

液相色譜-質(zhì)譜儀，其中液相系統(tǒng)為1290 型，質(zhì)譜為6470型，均購自Aglient公司；電子天平：PL206型，購自瑞士梅特勒公司。

1.2 主要試劑

磺胺甲基嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司；色譜純甲醇、乙腈購自默克公司；實驗用水由Milipore 純水系統(tǒng)制備。

1.3 液質(zhì)分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL ；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫條件：0～1 min B為5%，1～3 min B為5%～30%，3～4 min B為30%～50%，4～6 min B為50%～100%，6～8 min B為100%，8.1～10 min B為5%。

1.3.2 質(zhì)譜條件

掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測方式：MRM 多反應(yīng)監(jiān)測；噴霧電壓：3 500 V ；氣流量：8 L/min；氣體溫度：250 ℃；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流量：12 L/min。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別稱取 7 種固體標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg置于20 mL容量瓶中，用適量甲醇超聲溶解，定容至20 mL，配制成1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g蜂王漿于50 mL離心管中，加入5 mL水溶解，渦旋振蕩1 min，使之全部溶解，再加入15 mL乙腈-水(V乙腈∶V水=80 ∶20)溶液，充分渦旋振蕩提取15 min，于4 ℃ 5 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，氮氣吹干，加入5 mL水渦旋振蕩復(fù)溶。將該溶液全部轉(zhuǎn)移至已經(jīng)預(yù)先活化好的HLB固相萃取柱，用10 mL水淋洗后，再用5 mL甲醇洗脫，用15 mL離心管收集全部洗脫液，40 ℃加熱條件下氮氣吹干，最后加入1 mL 乙腈 ∶水(10 ∶90)溶液，渦旋振蕩溶解殘渣，0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品中磺胺類藥物的提取

分別用幾種不同常見試劑來提取蜂王漿中殘留的磺胺類藥物，如二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、乙腈-水(V乙腈∶V水=80 ∶20)溶液等，通過比較加標(biāo)回收的回收率來擇優(yōu)選用，其中用乙腈-水(V乙腈∶V水=80 ∶20)溶液提取效果最好，所得回收率最高。故本實驗中用乙腈-水(V乙腈∶V水=80 ∶20)溶液做提取試劑。

2.2 儀器條件優(yōu)化

首先摸索7種磺胺類藥物的最適質(zhì)譜條件，比較不同裂解電壓與碰撞能量對母離子與子離子響應(yīng)值的影響，選出其中響應(yīng)值最高的子離子作為定量離子，響應(yīng)值稍低的作為定性離子，具體參數(shù)見表1。

其次優(yōu)化色譜條件，初次選擇乙腈-水為流動相，磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉的峰形有較嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，因此在水相中加入了低濃度的甲酸(0.1%)水溶液，峰形得到了較好的改善。設(shè)置梯度洗脫程序，逐漸增加有機(jī)相比例，能夠在 10 min 內(nèi)完成7種磺胺類藥物的分析。具體7種化合物的總離子流(TIC)圖如圖1所示。

表1 7種磺胺類藥物的質(zhì)譜條件

1─磺胺甲惡唑；2─磺胺甲基嘧啶； 3─磺胺氯噠嗪；4─磺胺二甲嘧啶；5─磺胺二甲氧嘧啶；6─磺胺間甲氧嘧啶；7─磺胺喹惡林。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及檢出限、定量限

液質(zhì)實驗中常常受到基質(zhì)效應(yīng)的影響，不同的基質(zhì)會干擾目標(biāo)化合物的響應(yīng)值，使信號增強(qiáng)或減弱，會影響方法的定量限、準(zhǔn)確度等。因此本文使用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別稱取6份質(zhì)量為5.0 g蜂王漿，分別加入不同體積的混標(biāo)溶液，最后配成質(zhì)量濃度為0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 ng/mL溶液，按上述前處理方法進(jìn)行測定。以被測組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中方法檢出限 (LOD)為3倍信噪比(S/N)所對應(yīng)的濃度，定量限 (LOQ)為10倍信噪比(S/N)所對應(yīng)的濃度。數(shù)據(jù)處理后所得7個磺胺類藥物的對應(yīng)曲線方程、檢出限與定量限見表2。結(jié)果表明7種磺胺類藥物對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為 0.9955～0.9987，方法檢出限為0.5～8.0 μg/kg，定量限為1.0～10.0 μg/kg。

表2 7種磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)

化合物名稱標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù) r2磺胺甲基嘧啶 y=40938.38x-852.420.997 7磺胺氯噠嗪 y=45150.49x-2355.260.997 2磺胺二甲嘧啶 y=49240.36x+412.200.997 7磺胺間甲氧嘧啶 y=33846.96x-745.980.997 2磺胺甲惡唑 y=21317.87x-119.410.998 2磺胺間二甲氧嘧啶y=163807.17x+1919.110.998 7磺胺喹惡啉 y=22198.37x-15.360.995 5

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

稱取5.0 g空白樣品，分別加入不同體積100 ng/mL的混標(biāo)溶液，設(shè)置高、中、低3個加標(biāo)濃度，其中低濃度為1倍檢出限，中濃度為2倍檢出限，高濃度為5倍檢出限。加標(biāo)后，按上述前處理方法進(jìn)行處理，設(shè)置空白對照，測定7種磺胺類藥物的回收率，結(jié)果見表3。

表3 7種磺胺類藥物的檢出限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表3可知，該方法回收率為79.29%～102.63%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.5%～8.4%，結(jié)果表明該方法的精密度、準(zhǔn)確度能夠滿足檢測要求。

2.5 實際樣品測定

用上述方法檢測了購自超市的10 批蜂王漿，均未檢出7種磺胺類藥物殘留。

3 結(jié)論

本文建立了蜂王漿中7種磺胺類藥物殘留的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法，檢出限為 0.5～8.0 μg/kg。該方法靈敏度高、前處理較簡單簡便、儀器分析時間較短、結(jié)果準(zhǔn)確，能夠滿足基層食品檢驗檢測實驗室的日常檢測要求，具有較廣闊的應(yīng)用前景。